Использование антибиотиков способствует росту резистентной флоры, не только патогенной, но и комменсалов (условно-патогенной), на фоне сохраняющейся бактерицидной или бактериостатической активности препаратов по отношению к облигатной анаэробной флоре (бифидобактерии, бактериоиды, клостридии, фузобактерии, пептострептококки, лактобактерии). Формирующиеся изменения спектра микробного пейзажа кишечника на фоне воздействия тетрациклина в виде нарушения соотношения между анаэробной и аэробной флорой (в норме 10:1) с подавлением роста облигатных микроорганизмов (лактобактерии, фузобактерии, пептострептококки, клостридии) приводит к увеличению доли Escherichia coli, Salmonella, Enterococci, стафилококков и др., то есть свидетельствуют о дисбалансе микрофлоры кишечника. В российской и международной медицинской практике определен ряд заболеваний, ассоциированных с нарушением баланса кишечной микрофлоры: синдром раздраженного кишечника (СРК) с диареей (K58.0), синдром раздраженного кишечника без диареи (K58.9), запор (K59.0), воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) (K50-K51). Таким образом, в качестве критического эффекта целесообразно рассматривать повышение устойчивой к тетрациклину микрофлоры и нарушение баланса микрофлоры кишечника, которое приводит к развитию заболеваний желудочно-кишечного тракта. Этот эффект установлен как на животных, так и на человеке. У детского населения с нарушением баланса микрофлоры в кишечнике связаны СРК с диареей (K58.0), запор (K59.0), функциональное нарушение кишечника неуточненное (K59.9), дуоденит (K29.8, K29.9), пищевая аллергия (T78.0, T78.1, T78.4), железодефицитная анемия (D50), атопические дерматиты (L20.8), общий вариабельный иммунодефицит неуточненный (D83.9) . Недействующая суточная доза (NOEL) тетрациклина была установлена комиссией Codex Alimentarius на уровне 2 мг в день (WHO 1990). Основанием для этого послужили результаты исследования действия тетрациклина на людей. В качестве критического эффекта рассматривалось воздействие на микрофлору кишечника (повышение уровня резистентности колиформ). При установлении допустимой суточной дозы (3 мкг на кг веса тела в сутки) принимался фактор неопределенности 10 из-за вариабельности кишечной флоры у людей. В сороковом докладе совместного экспертного комитета по пищевым добавкам FAO/WHO допустимая суточная доза тетрациклинов была из-за отказа от фактора неопределенности пересмотрена до 30 мкг на кг веса тела в сутки FAO/WHO 1998. Основанием для пересмотра послужили результаты эксперимента in vitro. Однако подобное решение является необоснованным по следующим причинам:

1. Допустимая суточная доза устанавливается для условий потребления продуктов ежедневно в течение всей жизни и не может базироваться на данных, полученных в краткосрочном эксперименте in vitro без соответствующего анализа неопределенности, учитывающего перенос результатов, полученных in vitro на человека, данных краткосрочного исследования на воздействие в течение всей жизни.
2. Полученные при расчете допустимых суточных доз для тетрациклина и окситетрациклина для различных типов микроорганизмов, в соответствии с формулой, рекомендованной FAO/WHO (1), допустимые суточные дозы для 10 различных типов микроорганизмов варьировали от 0,37 мкг/кг массы тела в отношении Clostridium spp. до 195,6 мкг/кг массы тела для Escherichia coli и Proteus spp. Такая высокая вариабельность результатов указывает на необходимость включения в расчет допустимой суточной дозы дополнительного фактора неопределенности, особенно для наиболее чувствительных групп населения, например детей, и проведения оценки риска здоровью с учетом особенностей этих групп.
3. Высокая неопределенность данных, на основании которых предлагается отказаться от модифицирующего фактора 10.

Значения максимальных остаточных уровней (MRL) тетрациклина для взрослых для различных видов животных тканей и видов экспозиции представлены в табл. 1.

Таблица 1: Значения MRL для различных видов животных тканей и видов экспозиции

Продукт питания	WHO1990	FAO/WHO 1998	USA	ТС
Молоко, мкг/л	100	100	300	10
Мышечная ткань, мкг/кг	100	200	2000	10
Жировая ткань, мкг/кг	10		10	10
Яйца, мкг/кг	200	400	200	10
Печень, мкг/кг	300	600	300	10
Почки, мкг/кг	600	1200	600	10

Результаты оценки риска здоровью

Среди населения России заболевания ЖКТ ассоциируются с изменением состава микрофлоры первой степени от 18,6 до 34,8% , второй степени – от 24,2 до 45,7%, третьей степени – от 27,0 до 56,3% Среди детского населения также установлено нарушение баланса микрофлоры кишечника при указанных заболеваниях: первой степени – от 2,0 до 74,0%, второй степени – от 26,0 до 84,0% и третьей степени – от 0,0 до 39,1%. Оценка риска развития нарушения баланса микрофлоры кишечника и последующего увеличения риска, ассоциированных с ним заболеваний у детей с учетом особенностей экспозиции для этой группы показала, что при возникновении дисбаланса кишечной микрофлоры у детей, в том числе обусловленного остаточными концентрациями тетрациклина в пищевых продуктах более 10 мкг/кг, увеличивается риск болезней органов пищеварения до уровня 0,000461, дерматитов до 0,000725, пищевой аллергии до 0,000149, болезней крови до 0,001372. Увеличение риска заболеваемости детского населения Российской Федерации болезнями системы пищеварения может составить до 4% случаев, болезнями крови – до 8% случаев, болезнями кожи – до 0,9% случаев, аллергических заболеваний – до 0,1% случаев. Таким образом, как и страны Европейского союза, Российская Федерация считает, что отказ от коэффициента неопределенности 10 при установлении допустимой суточной дозы недостаточно обоснован, установление ДСД (ADI) на уровне 30 мкг на кг веса тела не имеет соответствующих обоснований и без устранения неопределенности результатов преждевременно. ДСД (ADI) на уровне 3 мкг на кг веса тела и, соответственно, установление допустимых остаточных количеств тетрациклинов на уровне 100 мкг/л в молоке, 100 мкг/кг в мышечной ткани, 10 мкг/кг в жировой ткани, 200 мкг/кг в яйцах, 300 мкг/кг в печени, 600 мкг/кг в почках может привести к дополнительному риску болезней органов пищеварения, анемии, дерматитов, аллергии и иммунодефицитных состояний у детей. Установление допустимых остаточных количеств тетрациклинов в пищевых продуктах на уровне 10 мкг/кг (0,01 мг/кг) является оправданным и не приведет к увеличению риска для здоровья населения, в том числе наиболее чувствительных субпопуляций.  

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

МАТЕРИАЛЫ К ОЦЕНКЕ РИСКА ЗДОРОВЬЮ НАСЕЛЕНИЯ ПРИ ПОСТУПЛЕНИИ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ

Москва, 2012

Авторский коллектив: ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Зайцева Н.В., Шур П.З., Кирьянов Д.А., Аминова А.И., Камалтдинов М.Р., Атискова Н.Г.).

Содержание

1. Идентификация опасности (Hazard identification) 4 Распределение в организме. 4 Основные эффекты.. 5 2. Характеристика опасности (Hazard characterization) 8 Допустимые уровни воздействия. 8 Оценка зависимости «экспозиция – эффект». 11 3. Оценка экспозиции (Dietary exposure assessment) 13 4. Характеристика риска (Risk characterization) 18 5. Оценка неопределенности результатов. 22 Приложение. 25 Список литературы.. 35

1. Идентификация опасности (Hazard identification) Хлортетрациклины и тетрациклины являются антибактериальными препаратами широкого спектра действия с долгой историей использования для лечения животных и человека. Группа тетрациклинов – бактериостатические антибиотики, нарушают образование комплекса между транспортной РНК и рибосомой, что приводит к подавлению синтеза белка. Тетрациклин активен в отношении грамположительных микроорганизмов: Staphylococcus spp. (в том числе Staphylococcus aureus, включая продуцирующие пенициллиназу штаммы), Streptococcus spp. (в том числе Streptococcus pneumoniae), Listeria spp., Bacillus anthracis, Clostridium spp., Actinomyces israelii; грамотрицательных микроорганизмов: Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella pertussis, большинства энтеробактерий: Escherichia coli, Enterobacter spp., включая Enterobacter aerogenes, Klebsiella spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia pestis, Bartonella bacilliformis, Vibrio cholerae, Vibrio fetus, Rickettsia spp., Borrelia burgdorferi, Brucella spp., активен также в отношении возбудителей венерической и паховой лимфогранулемы, Treponema spp. К тетрациклину устойчивы микроорганизмы: Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Serratia spp., большинство штаммов Bacteroides spp. и грибов, вирусы, бета-гемолитические стрептококки группы А (включая 44% штаммов Streptococcus pyogenes и 74 % штаммов Streptococcus faecalis). Распределение в организме Исследования фармакокинетики тетрациклинов показали, что в желудочно-кишечном тракте человека абсорбируется до 60% препарата, тогда как у мышей и крыс абсорбция составляет 4-9% [1]. Это является свидетельством высокой неопределенности при переносе результатов экспериментов с животных на человека. В токсикологических экспериментах на крысах и собаках пиковые концентрации тетрациклина были обнаружены в печени и почках.   При введении белым крысам единичной дозы тетрациклина 75 мг/кг пиковые концентрации в плазме (до 3,6 мг/л) были обнаружены после 2 часов после введения, уменьшаясь до 0,5 мг/л после 6 часов. Пиковые концентрации были обнаружены в печени и почках через 2 часа после введения [2]. При введении тетрациклина гидрохлорида внутривенно собакам (10 мг/кг) наибольший уровень был обнаружен в печени и почках [3]. При поступлении пероральным путем собакам в дозе 25 мг/кг пиковые концентрации составили 3 мг/мл после 2 часов, снижаясь до уровня 0,27 после 24 часов после введения. Выведение антибиотика происходит преимущественно с мочой. В течение 72 часов после внутривенного введения тетрациклина 2 крысам и 1 собаке в дозе 15 или 4 мг/кг, соответственно 69,2% и 19,5 % антибиотика было обнаружено в моче [2]. Существенная вариабельность приведенных результатов является свидетельством высокой неопределенности при переносе результатов экспериментов с животных на человека. Основные эффекты В токсикологических экспериментах установлены слабость и анорексия после введения собакам внутривенно дозы тетрациклина 50 и 100 мг/кг, а доза в 150 мг/кг вызвала удушье, общий парез и смерть в пределах нескольких часов [4]. Пероральное введение группе мышей 0, 0,31, 0,63, 1,25, 2,5 или 5 % раствора тетрациклина гидрахлорида в течение 13 недель (что эквивалентно 470, 950, 1800, 3700 или 7500 мг/кг массы тела/день, соответственно) был понижен вес у 16% самок и 5 % самцов. Увеличивалось содержание тетрациклина в костях мышей при увеличении дозы. Наблюдалась костная атрофия при уровне 1250 и 2500 мг/кг (NTP,1989) [5]. При введении группе собак 0,1, 0,3 или 1% раствора тетрациклина гидрохлорида на протяжении 24 месяцев костная структура имела желтый окрас. Интенсивность цвета соответствовала введенной дозе. Наблюдалась черно-коричневая пигментация у всех групп [6]. Высокие дозы тетрациклинов на уровне 2500 и 7500 мг/кг веса могут вызывать снижение массы тела и ограниченные жировые изменения в печени крыс. Изменений репродукции не установлено при дозе эквивалентной 18 мг/кг. Не выявлено мутагенных и тератогенных эффектов воздействия тетрациклинов. При хроническом оральном введении 2000 мг/кг окситетрациклина в течение 103 недель у самцов мышей отмечен канцерогенный эффект, но он не был признан значимым [1]. В мировой научной литературе достаточно свидетельств о том, что использование антибиотиков способствует росту резистентной флоры, не только патогенной, но и комменсалов (условно-патогенной), на фоне сохраняющейся бактерицидной или бактериостатической активности препаратов по отношению к облигатной анаэробной флоре (бифидобактерии, бактериоиды, клостридии, фузобактерии, пептострептококки, лактобактерии). Уровень комменсалов (Escherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. и Еnterococci) – является прогнозным показателем индукции резистентности бактерий на фоне антибиотикотерапии и косвенным показателем ожидаемой резистентности патогенной флоры. Мониторинговое наблюдение за устойчивостью комменсалов (Escherichia coli и Еnterococci) является показателем распространенности антибиотикорезистентности в популяции [7]. Формирующиеся изменения спектра микробного пейзажа кишечника на фоне воздействия тетрациклина в виде нарушения соотношения между анаэробной и аэробной флорой (в норме 10:1) с подавлением роста таких облигатных микроорганизмов, как лактобактерии, фузобактерии, пептострептококки, клостридии приводит к увеличению доли Escherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. and Enterococci, стафилококков и др., то есть свидетельствуют о дисбалансе микрофлоры кишечника [7, 8, 9, 10, 11, 12]. Данное нарушение микробного состава кишечной флоры определяется как синдром избыточного бактериального роста тонкой кишки (СИБР). Исследование состава микробной флоры кишечника при СИБР выявило с высокой степенью достоверность дисбиотических нарушений у обследованных 54% (95% CI, 32%-76%), в отличие от здоровых лиц 31% (95% CI, 14%-50%) [13]. По данным литературы при СИБР в составе микробной флоры преобладают Streptococci (71%), Escherichia coli (69%), Staphylococci (25%), Micrococci (22%), and Klebsiella (20%) [14, 15, 16, 17]. В российской и международной медицинской практике определен ряд заболеваний, ассоциированных с нарушением баланса кишечной микрофлоры. В соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра [51] это такие заболевания как синдром раздраженного кишечника (СРК) с диареей (K58.0), синдром раздраженного кишечника без диареи (K58.9), запор (K59.0), воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) (K50-K51). Инициация роста факультативной флоры кишечника может увеличивать риск возникновения патологических процессов [18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Таким образом, в качестве критического эффекта целесообразно рассматривать повышение устойчивой к тетрациклину микрофлоры и нарушение баланса микрофлоры кишечника, которое приводит к развитию заболеваний желудочно-кишечного тракта. Этот эффект установлен как на животных, так и на человеке. У детского населения с нарушением баланса микрофлоры в кишечнике могут быть связаны СРК с диареей (K58.0), запор (K59.0), функциональное нарушение кишечника неуточненное (K59.9), дуоденит (K29.8, K29.9), пищевая аллергия (T78.0, T78.1, T78.4), железодефицитная анемия (D50), другие атопические дерматиты (L20.8), общий вариабельный иммунодефицит неуточненный (D83.9) [52, 53, 54].    

2. Характеристика опасности (Hazard characterization)

Допустимые уровни воздействия. Нормативы допустимых уровней тетрациклина – допустимая суточная доза (ДСД/ADI) и максимально допустимые уровни содержания в пищевых продуктах (МДУ/MRL) зафиксированы в 1990 году в тридцать шестом докладе совместного экспертного комитета по пищевым добавкам FAO/WHO (JECFA) [1]. Недействующая суточная доза (NOEL) тетрациклина установлена на уровне 2 мг в день. Основанием для этого послужили результаты исследования действия тетрациклина на людей. В качестве критического эффекта рассматривалось воздействие на микрофлору кишечника (повышение уровня резистентности колиформ). В том же исследовании определена минимальная действующая доза 20 мг в день. В качестве ключевого эффекта исследовалось изменения микрофлоры кишечника. Выбор ключевого эффекта полностью адекватен и подтвержден результатами большого числа исследований, не вызывающих сомнений. Установленная в токсикологических исследованиях недействующая суточная доза составила 18 мг/сут. При установлении допустимой суточной дозы (3 мкг на кг веса тела в сутки) принимался фактор неопределенности 10 из-за вариабельности кишечной флоры у людей. При этом использовался консервативный подход из-за отсутствия исследований в диапазоне доз от 2 до 20 мг в сутки и отмечалось, что реальная допустимая суточная доза может быть несколько выше установленной. В сороковом докладе совместного экспертного комитета по пищевым добавкам FAO/WHO допустимая суточная доза тетрациклинов была пересмотрена [26]. Основанием для пересмотра послужили результаты эксперимента in vitro по исследованию дозировок, эквивалентных 0,025, 0,25 и 2,5 мг/кг веса тела. Установлено, что при эквиваленте дозы 2,5 мг/кг веса тела в течение 24 часов наблюдается увеличение доли резистентных E.coli с менее, чем 20 до более, чем 50%, эта доля уменьшилась до 35% на шестой день. В контрольном эксперименте без применения тетрациклина доля резистентных e.coli не превышала 5%. При эквивалентах доз 0,025 и 0,25 мг/кг веса тела эффекта не наблюдали. Комитет на основе данных исследований заключил, что вариабельность среди индивидуумов является малой и фактор неопределенности больше применять нецелесообразно, следовательно, в качестве допустимой суточной дозы следует принять 30 мкг на кг веса тела в сутки. Однако подобное решение является необоснованным по следующим причинам: 1. Допустимая суточная доза устанавливается для условий потребления продуктов ежедневно в течение всей жизни и не может базироваться на данных, полученных в краткосрочном эксперименте in vitro без соответствующего анализа неопределенности, учитывающего перенос результатов, полученных in vitro на человека, данных краткосрочного исследования на воздействие в течение всей жизни [27, 28]. 2. В соответствии с формулой (1), рекомендованной FAO/WHO [29], был проведен расчет допустимых суточных доз для тетрациклина и окситетрациклина для различных типов микроорганизмов. (1) Формула была разработана на основе модального значения MIC₅₀ (MIC₅₀ – минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая рост 50% культур определенного микроорганизма), фактора запаса для учета разного рода вариабельностей, массой кишечного содержимого, веса индивидуума и биодоступности пероральной дозы антибиотика. Значения MIC₅₀ тетрациклина и окситетрациклина для 10 различных микроорганизмов были взяты в соответствии с WHO Food Additives Series 36, значение фактора запаса – 1, доля биодоступной пероральной дозы тетрациклинов – 0,6, масса содержимого кишечника – 220г, средняя масса индивидуума – 60 кг. Полученные при расчете, в соответствии с формулой (1), допустимые суточные дозы для 10 различных типов микроорганизмов варьировали от 0,37 мкг/кг массы тела в отношении Clostridium spp. до 195,6 мкг/кг массы тела для Escherichia coli и Proteus spp.(таблица 1); такая высокая вариабельность результатов может указывать на необходимость включения в расчет допустимой суточной дозы дополнительного фактора неопределенности, особенно для наиболее чувствительных групп населения, например детей, проведение оценки риска здоровью с учетом особенностей этих групп.

Таблица 1

Микроорганизм	Допустимая суточная доза, мкг/кг
Escherichia coli	195,56
Bifidobacterium spp.	97,78
Bacteroides fragilis	24,44
Eubacterium spp.	12,22
Clostridium spp.	0,38
Streptococcus spp.	97,78
Fusobacterium spp.	0,76
Lactobacillus spp.	12,22
Proteus spp.	195,56
Peptostreptococcus spp.	12,22

3. Основанием для отказа от использования фактора неопределенности при установлении ДСД(ADI) тетрациклинов послужили результаты эксперимента in vitro [26]. Было показано, что изучались концентрации, эквивалентные недействующим дозам 0,025, 0,25 и 2,5 мг/кг веса тела и предложены выводы о том, что дозы 0,025, и 0,25 мг/кг веса тела являются недействующими. При этом не удалось установить, каким образом осуществлялась оценка эквивалентности доз уровням воздействия на микрофлору в хемостате. Оценка предлагаемого соотношения с применением формулы 1 показала несопоставимость полученных результатов. Это свидетельствует о высокой неопределенности данных, на основании которых недостаточно мотивировано предлагается отказаться от модифицирующего фактора 10 и допустимой суточной дозы 3 мкг/кг массы тела. Оценка зависимости «экспозиция – эффект» Формирование дисбаланса микробной флоры кишечника по данным исследований in vitro можно проиллюстрировать результатами математического моделирования роста факультативной микрофлоры на фоне подавления облигатной флоры, прежде всего бифидобактерий (рис. 1, приложение).    

Рисунок 1 – Зависимость относительной численности кишечной микрофлоры (%) от концентрации тетрациклина

  Принципиальная закономерность замещения облигатной флоры кишечника факультативной представлена на рисунке 2.

Рисунок 2 –Соотношение факультативной и облигатной кишечной микрофлоры

В научных исследованиях, посвященных изучению патогенетических процессов в кишечнике [30, 31, 32, 33] представлены материалы по частоте нарушений баланса микроорганизмов различной степени при различных заболеваниях (таблица 2, 3).

Таблица 2

Частота нарушений баланса микрофлоры кишечника при различных заболеваниях (взрослые), %

Группа (код МКБ10)	Отсутствие	1 степень	2 степень	3 степень
СРК с диареей (K58.0)	0	37,8	35,1	27,0
СРК без диареи (K58.9)	0	18,6	45,8	35,6
Запор (K59.0)	0	21,2	24,2	54,5
ВЗК ( K50-K51)	0	0,00	43,7	56,3

  По результатам проведенных исследований среди всего населения при указанные заболевания ассоциируются с изменением состава микрофлоры первой степени от 18,6 до 34,8% , второй степени – от 24,2 до 45,7%, третьей степени – от 27,0 до 56,3%.

Таблица 3

Частота нарушений баланса микрофлоры кишечника при различных заболеваниях (дети), %

Группа (код МКБ10)	Нарушение баланса
	Отсутствие нарушений	1 степень	2 степень	3 степень
СРК с диареей (K58.0)	0	22,2	66,7	11,1
Запор (K59.0)	0	74,0	26,0	0
Функциональное нарушение кишечника неуточненное (K59.9)	0	15,0	84,0	1,0
Железодефицитная анемия (D50)	0	39,8	46,6	13,6
Другие атопические дерматиты (L20.8)	0	40,6	37,2	22,2
Дуоденит (K29.8, K29.9)	26,7	31,5	33,7	8,1
Пищевая аллергия (T78.0, T78.1, T78.4)	1,4	12,6	46,9	39,1
Общий вариабельный иммунодефицит неуточненный (D83.9)	0	2,0	80,0	18,0

  Среди детского населения также установлено нарушение баланса микрофлоры кишечника при указанных заболеваниях: первой степени – от 2,0 до 74,0%, второй степени – от 26,0 до 84,0% и третьей степени – от 0,0 до 39,1%.

3. Оценка экспозиции (Dietary exposure assessment)

Оценка экспозиции проводится на основе максимальных остаточных уровней (MRL) тетрациклина для различных групп продуктов питания животного происхождения с учетом среднего уровня суточного потребления соответствующих продуктов. Так, по данным Vol. 8 Notice to applicants and notes for guidance (Establishment of maximum residue limits (MRLs) for residues of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin) (Belgium, 2003) принимается следующее суточное содержание продуктов животного происхождения в продуктовой корзине жителей стран Европы (табл. 4). Для населения Российской Федерации предлагаются следующие суточные нормы потребления продуктов животного происхождения, используемых для оценки экспозиции тетрациклинов, установленные на основании доступных данных за 2005-2009 г.г. (табл. 5).

Таблица 4

Суточное содержание продуктов животного происхождения в продуктовой корзине (Belgium, 2003)

 

Таблица 5

Суточные нормы потребления продуктов животного происхождения для населения Российской Федерации

Пищевые продукты	Уровень суточного потребления, кг
Мясо (мышечная ткань)	0,127
Печень	0,005
Почки	0,003
Съедобные жиры животного происхождения	0,0013
Яйца	0,034
Молоко	0,126

  На основе представленных данных было установлено максимальное суточное поступление тетрациклина с продуктами питания для взрослого населения для шести сценариев экспозиции. Первые три сценария экспозиции основываются на данных о среднем суточном потреблении продуктов питания животного происхождения жителями Европы и значениях максимальных остаточных уровней (MRL) тетрациклина, рекомендованных WHO (1990) (сценарий 1), FAO/WHO (1998) (сценарий 2) и принятых в США (сценарий 3). В основу сценариев 4, 5 и 6 положены уровни суточного потребления продуктов животного происхождения для взрослого населения РФ и также, значения MRL тетрациклина, рекомендованные WHO (1990), FAO/WHO (1998) и принятые в США, для сценариев 4, 5 и 6, соответственно. Значения максимальных остаточных уровней тетрациклина для взрослых для различных видов животных тканей и видов экспозиции представлены в табл. 6.  

Таблица 6

Значения MRL для различных видов животных тканей и видов экспозиции

  Полученные значения максимального суточного поступления тетрациклина для взрослых для всех шести сценариев экспозиции с учетом средней массы тела (60 кг) представлены в табл. 7.

Таблица 7

Значения максимального суточного поступления тетрациклина для исследуемых сценариев экспозиции

С учетом средней массы содержимого кишечника – 220г (Toxicological evaluation of certain veterinary drug residues in food. WHO Food Additives Series, No. 38, 1996; Studies to evaluate the safety of residues of veterinary drugs in human food: general approach to establish a microbiological ADI, London, 2007) рассчитаны концентрации тетрациклина в желудочно-кишечном тракте для условий шести вариантов экспозиции (табл. 8).

Таблица 8

Концентрации тетрациклина в желудочно-кишечном тракте для исследуемых сценариев экспозиции

Таким образом, концентрация тетрациклина в желудочно-кишечном тракте взрослого населения для шести исследуемых сценариев экспозиции варьировала от 0,11 мкг/г (сценарий 4) до 2,4 мкг/г (сценарий 3). Дополнительно при установлении концентрации тетрациклина в желудочно-кишечном тракте детского населения были разработаны 4 сценария экспозиции. Все сценарии экспозиции основываются на данных о среднем суточном потреблении продуктов питания животного происхождения детским населением Российской Федерации и значениях МДУ тетрациклина, принятых в РФ (10 мкг/кг) (сценарий 7), максимальных остаточных уровней (MRL) тетрациклина, рекомендованных WHO (1990) (сценарий 8), FAO/WHO (1998) (сценарий 9) и принятых в США (сценарий 10). Показатели суточного содержания продуктов животного происхождения в рационе питания детского населения 3-7 лет в соответствии с методическими указаниями г. Москвы «Организация питания в дошкольных образовательных учреждениях» 2007г. [49] представлены в таблице 9.

Таблица 9

Суточные нормы потребления продуктов животного происхождения для детского населения Российской Федерации

Пищевые продукты	Уровень суточного потребления, кг
Мясо (мышечная ткань)	0,074
Печень	0,007
Яйца	0,048
Молоко	0,558

  Полученные значения максимального суточного поступления тетрациклина для детского населения в условиях исследуемых сценариев экспозиции с учетом средней массы тела (20 кг) представлены в табл. 10.

Таблица 10

Значения максимального суточного поступления тетрациклина для исследуемых сценариев экспозиции

  С учетом средней массы содержимого кишечника детей (50г) (Камышникова, 2007) [50] рассчитаны концентрации тетрациклина в желудочно-кишечном тракте для условий четырех вариантов экспозиции (табл. 11).

Таблица 11

Концентрации тетрациклина в желудочно-кишечном тракте детей для исследуемых сценариев экспозиции

Таким образом, концентрация тетрациклина в желудочно-кишечном тракте детского населения для четырех исследуемых сценариев экспозиции варьировала от 0,069 мкг/г (сценарий 7) до 7,2 мкг/г (сценарий 10).  

4. Характеристика риска (Risk characterization)

Оценка риска здоровью при воздействии тетрациклинов, поступающих с продуктами питания, производилась для шести сценариев, предложенных на этапе оценки экспозиции. В результате моделирования нарушения баланса микрофлоры в кишечнике установлено, что безопасными для здоровья являются сценарии 4 и 5, при которых содержание факультативных микроорганизмов не превышает 5% от общего количества бактерий. Реализация сценариев 1 – 3 и 6 может быть связана с ингибированием облигатной микрофлоры и приводить к дисбалансу микрофлоры кишечника различной тяжести (табл. 12).

Таблица 12

Баланс микрофлоры кишечника при различных сценариях поступления тетрациклинов с пищевой продукцией, % от общего количества бактерий

 

Вид бактерий	Сценарий 1	Сценарий 2	Сценарий 3	Сценарий 4	Сценарий 5	Сценарий 6
Бифидобактерии spp.	84,31	79,57	75,63	89,28	88,51	85,67
Бактероиды spp.	1,54	1,20	1,03	2,59	2,29	1,70
Клостридии spp.	0,003	0,002	0,002	0,006	0,005	0,003
Фузобактерии spp.	0,17	0,11	0,09	0,53	0,37	0,20
Лактобактерии	1,06	0,42	0,19	2,64	2,30	1,37
Пептострептококки	0,67	0,53	0,46	0,94	0,88	0,72
E. Coli (кишечная палочка)	0,96	0,93	0,91	0,99	0,98	0,97
Факультативные бактерии	11,28	17,23	21,69	3,03	4,66	9,37

 

Нарушения микробного баланса под воздействием разнообразных причин происходит при изменении соотношения между облигатной и факультативной флорой. При первой степени микробного дисбаланса толстого кишечника – происходит снижение количества облигатной флоры (в основном бифидобактерий), при этом за счет сохранения ингибирующего влияния бифидобактерий, лактобактерий и кишечной палочки (так называемая колонизационная резистентность) не происходит увеличения условной патогенной (факультативной) флоры. Следует отметить, что первая степень дисбактериоза часто не имеет характерной клинической симптоматики, имеет транзиторный характер и выявляется при массовых обследованиях по данным литературы у 50-90% населения. Вторая степень нарушения микробиоциноза кишечника характеризуется увеличением количества условной патогенной (факультативной) флоры выше нормальных значений (5-10%) [34, 35, 36, 37, 38].

Прогнозные показатели индивидуального риска болезней органов пищеварения, связанных с дисбалансом микрофлоры в кишечнике, рассчитанные на примере одного из типичных промышленно развитых регионов Российской Федерации, составляют для лиц с чувствительной к тетрациклинам облигатной микрофлорой кишечника 0,000084 – 0,003664 (таблица 4). Результаты расчетов индивидуального риска дополнительной заболеваемости для различных степеней нарушений баланса микрофлоры представлены в таблице 13.

Таблица 13

Индивидуальный риск дополнительной заболеваемости населения для различных степеней нарушений баланса микрофлоры

  Контингент риска – лица с чувствительной к тетрациклину микрофлорой кишечника составляют до 70% населения [40]. С учетом этого потребление пищевой продукции, содержащей тетрациклины, может при нарушении баланса микрофлоры кишечника увеличить риск ряда заболеваний органов пищеварения (K58.0, K58.9, K59.0, K50-K51) у населения России на 23% случаев (приложение). В качестве модельной наиболее чувствительной группы населения для оценки риска здоровью использовались дети в возрасте 1-11 лет. Оценка риска развития нарушения баланса микрофлоры кишечника и последующего увеличения риска, ассоциированных с ним заболеваний у детей с учетом особенностей экспозиции для этой группы показала, что риск развития нарушения баланса микрофлоры кишечника под воздействием тетрациклинов для этой группы отсутствует только при потреблении продуктов питания с остаточными количествами антибиотиков в пищевых продуктах на уровне не более 10 мкг/кг (сценарий 7, табл. 14).

Таблица 14

Баланс микрофлоры кишечника детей при различных сценариях поступления тетрациклинов с пищевой продукцией, % от общего количества бактерий

Вид бактерий	Сценарий 7	Сценарий 8	Сценарий 9	Сценарий 10
Бифидобактерии spp.	89,58	78,99	71,37	53,44
Бактероиды spp.	2,74	1,17	0,91	0,62
Клостридии spp.	0,006	0,002	0,002	0,002
Фузобактерии spp.	0,64	0,11	0,07	0,04
Лактобактерии	2,79	0,38	0,08	0,00
Пептострептококки	0,96	0,52	0,40	0,26
E. Coli (кишечная палочка)	0,99	0,93	0,88	0,76
Факультативные бактерии	2,29	17,9	26,28	44,87

  С учетом частоты различных заболеваний, ассоциированных с нарушением баланса микрофлоры кишечника у детей и заболеваемости детского населения в модельном регионе Российской Федерации индивидуальный риск болезней органов пищеварения (K58.0, K59.0, K59.9, K29.8, K29.9) [51] составит от 0,000081 до 0,001238. Кроме того, нарушение баланса микрофлоры кишечника может обусловить дополнительный риск у детей анемии, дерматитов, аллергии и иммунодефицитных состояний (табл. 15, приложение).

Таблица 15

Индивидуальный риск дополнительной заболеваемости для различных степеней нарушений баланса микрофлоры (дети)

  Контингент риска – дети с чувствительной к тетрациклину микрофлорой кишечника составляют до 70% населения [40]. С учетом этого потребление пищевой продукции, содержащей остаточные количества тетрациклинов на уровне более 10 мкг/кг, может при нарушении баланса микрофлоры кишечника увеличить риск ряда заболеваний у детского населения России (приложение). Таким образом, у детей при возникновении дисбаланса кишечной микрофлоры, в том числе обусловленного остаточными концентрациями тетрациклина в пищевых продуктах более 10 мкг/кг, увеличивается риск болезней органов пищеварения до уровня 0,000461, дерматитов до 0,000725, пищевой аллергии до 0,000149, болезней крови до 0,001372. Увеличение риска заболеваемости детского населения Российской Федерации болезнями системы пищеварения может составить до 4% случаев, болезнями крови – до 8% случаев, болезнями кожи – до 0,9% случаев, аллергических заболеваний – до 0,1% случаев.   5. Оценка неопределенности результатов Возможные неопределенности подразделяются на три категории: – обусловленные отсутствием или неполнотой информации; – связанные с параметрами, используемыми для оценки экспозиции и расчета рисков (неопределенность параметров); – обусловленные пробелами в научной теории, необходимой для предсказания на основе причинных связей (неопределенности модели). К первой относятся недостаточно полная информация о возможных эффектах при хроническом воздействии тетрациклинов на организм человека, неопределенности, связанные с переносом данных экспериментов на животных и in vitro на человека, вариабельность микрофлоры в кишечнике с учетом ее устойчивости к внешним воздействиям. Ко второй категории можно отнести неопределенности, связанные с потреблением пищевых продуктов. Например, в Российской Федерации имеется тенденция к увеличению доли мясных и молочных продуктов в рационе населения. Отсутствуют достоверные прогнозные оценки содержания тетрациклинов в продуктах питания. К неопределенностям моделей следует отнести и ограниченное количество данных исследований, по результатам которых вычислялись параметры моделей. Величины этих параметров могут варьироваться в популяции, неточность в их определении может определяться использованием обобщенных, усредненных данных для больших популяций. Применение стандартных величин увеличивает неопределенности оценок экспозиции и риска, степень которых характеризуется на основе анализа чувствительности параметров. Кроме того, неопределенности таких параметров, как допустимые суточные дозы связаны с применением модифицирующих факторов или необоснованных отказом от их использования. Неопределенности третьей категории обусловлены недостаточно полным представлением о закономерностях формирования нарушений баланса микрофлоры и связанных с этим нарушений здоровья населения. В целом, неопределенность результатов исследования следует охарактеризовать как высокую. При этом безопасность для здоровья населения может быть обеспечена в ближайшее время при помощи применения факторов неопределенности при установлении гигиенических нормативов с их корректировкой в дальнейшем на основании результатов эпидемиологических исследований.                          

Заключение

Таким образом, как и страны Европейского союза [41], Российская Федерация считает, что отказ от коэффициента неопределенности 10 при установлении допустимой суточной дозы недостаточно обоснован, установление ДСД (ADI) на уровне 30 мкг на кг веса тела не имеет соответствующих обоснований и без устранения неопределенности результатов преждевременно. ДСД (ADI) на уровне 3 мкг на кг веса тела и, соответственно, установление допустимых остаточных количеств тетрациклинов на уровне 100 мкг/л в молоке, 100 мкг/кг в мышечной ткани, 10 мкг/кг в жировой ткани, 200 мкг/кг в яйцах, 300 мкг/кг в печени, 600 мкг/ кг в почках может привести к дополнительному риску болезней органов пищеварения, анемии, дерматитов, аллергии и иммунодефицитных состояний у детей. Установление допустимых остаточных количеств тетрациклинов в пищевых продуктах на уровне 10 мкг/кг (0,01 мг/кг) является оправданным и не приведет к увеличению риска для здоровья населения, в том числе наиболее чувствительных субпопуляций.                                          

Приложение

По данным ВОЗ [2, 41] установлены Mic_50, Mic₉₀ (концентрация при которой ингибируется 50 и 90% бактерий). В таблице 1 представлен состав нормальной микрофлоры и данные минимальных ингибирующих концентраций Mic_50, Mic₉₀.  

Таблица 1

Значения MIC₅₀, MIC₉₀ тетрациклина в отношении микрофлоры кишечника человека

Вид бактерий	Доля в нормальной микрофлоре кишечника, %	Mic50, мкг/мл	Mic90, мкг/мл
Бифидобактерии spp.	85	16	32
Бактероиды spp.	4,99	1	32
Клостридии spp.	0,01	0,062	32
Фузобактерии spp.	2	0,125	–
Лактобактерии	4	2	2
Пептострептококки	2	2	32
E. Coli (кишечная палочка)	1	32	64
Факультативная флора	1	–	–

  Для расчета промежуточных значений минимальных ингибирующих концентраций можно использовать модель, предложенную А. Фазилом [43] и основанную на бета-распределении Пуассона:

, (1)

где – процент ингибируемых бактерий i-го вида, C – концентрация тетрациклина в кишечнике, – параметры модели. Для оценки параметров с помощью пакета Matlab для каждого вида бактерий решалась система двух уравнений:

(2)

Результаты расчетов параметров для каждого вида бактерий кишечной микрофлоры приведены в таблице 2.

Таблица 2

Параметры моделей влияния концентрации тетрациклина на ингибирование бактерий кишечной микрофлоры

Вид бактерий	α	β
E. Coli (кишечная палочка)	0,00024	148,4
Бифидобактерии spp.	0,00048	148,4
Бактероиды spp.	3,09	0,5
Клостридии spp.	219,2	0,26
Фузобактерии spp.	0,68	14,27
Лактобактерии	0,0078	148,4
Пептострептококки	0,89	0,68

  На рисунке 1 приведены модели зависимости процента ингибирования от концентрации тетрациклина для различных бактерий.    

Рисунок 1 – Модели зависимости процента ингибирования от концентрации тетрациклина для различных бактерий

  Из рисунка 1 видно, что существует вариабельность чувствительности различных бактерий, содержащихся в кишечнике к тетрациклину. Следовательно, есть основания утверждать, что увеличение содержания тетрациклина в кишечнике приводит к изменению соотношения между различными видами бактерий. При этом, исходя из результатов исследования (Corpet D.E. [44], Shuhaimi M. et al. [45], Levy J. [46], Perrin-Guyomard A. et al. [47], Corpet D.E. [48]), в котором описан рост патогенной микрофлоры при угнетении полезных видов микроорганизмов, можно выполнить моделирование процессов изменения состава микрофлоры под действием тетрациклина на основе балансовых соотношений. Уравнение баланса микроорганизмов в кишечнике представляется в виде:

, (3)

где – количество бактерий i-го вида, N – общая численность микрофлоры. Так как угнетение одних бактерий приводит к освобождению пространства для роста других бактерий, происходит перераспределение процентного состава. Другими словами, на основе (3) можно составить соотношение целостности общего количества бактерий в виде:

, (4)

где – относительная численность кишечной микрофлоры i-го вида. На основе балансового уравнения (4) с учетом модели влияния тетрациклина на ингибирование бактерий различного вида (1) был выполнен расчет относительного состава кишечной микрофлоры в зависимости от концентрации тетрациклина по соотношению:

(5)

Результаты расчета представлены на рисунке 2.  

Рисунок 2 – Зависимость относительной численности кишечной микрофлоры (%) от концентрации тетрациклина

  Рисунок показывает закономерности изменения состава микрофлоры в условиях подавления роста одних бактерий и замещения их другими, резистентными к тетрациклину. Так, при увеличении концентрации тетрациклина относительная численность бифидобактерий падает, достигая 9%. При этом, развивается факультативная, резистентная к тетрациклину флора, которая при увеличении концентрации может достигать 91% численности всей бактериальной флоры. Графики изменения относительной численности каждого вида микрофлоры представлены на рисунке 3.

а) Бифидобактерии	б) Лактобактерии
в) Бактероиды	г) Фузобактерии
д) Пептострептококки	е) E.Coli
ж) Резистентные	з) Клостридии

Рисунок 3 – Изменение численности микрофлоры при воздействии тетрациклина

Кратность изменения кишечной микрофлоры () определяется по формуле:

, (6)

где – количество бактерий i-го вида в нормальной микрофлоре. Результаты расчета кратности изменения представлены на рисунке 4.  

Рисунок 4 – Зависимость кратности изменения нормального видового состава кишечной микрофлоры от концентрации тетрациклина

Кишечная флора представлена облигатной (пептострептококки, лактобактерии, бифидобактерии, фузобактерии, бактероиды, клостридии, кишечная палочка) и факультативной микрофлорой (аэробы, резистентные к тетрациклину). Графики изменения численности облигатной и факультативной кишечной микрофлоры представлены на рисунке 5.  

Рисунок 5 – Изменение баланса относительной численности кишечной микрофлоры (%) от концентрации тетрациклина

При уменьшении доли облигатной микрофлоры кишечника доля факультативной флоры возрастает (рисунок 6).  

Рисунок 6 – Соотношение долей факультативной и облигатной кишечной микрофлоры для различных суточных доз тетрациклина

  Из рисунков 5, 6 видно, что даже при небольших концентрациях тетрациклина возникают нарушения баланса нормальной микрофлоры. Эти явления могут привести к возникновению нарушений функций кишечника. В российской и международной медицинской практике существует ряд заболеваний, ассоциированных с нарушением баланса кишечной микрофлоры. Это такие заболевания как синдром раздраженного кишечника с диареей (K58.0), синдром раздраженного кишечника без диареи (K58.9), запор (K59.0), воспалительные заболевания кишечника (K50-K51). В научных исследованиях, посвященных изучению патогенетических процессов в кишечнике [31, 32, 33, 34] представлены материалы по частоте нарушений баланса микроорганизмов различной степени при различных заболеваниях (таблица 3).

Таблица 3

Частота нарушений баланса микрофлоры кишечника при различных заболеваниях (взрослые)

Группа (код МКБ10)	Нарушение баланса
	Отсутствие нарушений	1 степень	2 степень	3 степень
СРК с диареей (K58.0)	0 %	37,8 %	35,1 %	27 %
СРК без диареи (K58.9)	0 %	18,6 %	45,8 %	35,6 %
Запор (K59.0)	0 %	21,2 %	24,2 %	54,5 %
ВЗК (K50-K51)	0 %	0,00%	43,7 %	56,30 %

  Кроме того, в приведенных исследованиях показано, что у 84% населения наблюдается изменение состава микрофлоры (34,8% – первой степени, 45,7% – второй степени, 3,5% – третьей степени). Зная абсолютное количество случаев заболеваний, полученных из государственных статистических отчетных форм можно выполнить расчет дополнительных случаев заболеваний, ассоциированных с нарушением баланса микрофлоры в кишечнике. По данным выборочных исследований в модельном регионе Российской Федерации число случаев заболеваний, согласно данных таблицы 3 раскладывается по степеням нарушений баланса микрофлоры (таблица 4).

Таблица 4

Случаи заболеваний кишечника в модельном регионе Российской Федерации (взрослые)

  При формировании дисбаланса микрофлоры у населения будут развиваться патологические процессы в виде дополнительных случаев заболеваний:

, (7)

где – изменение количества случаев i-го заболевания с j-ой степенью нарушений баланса микроорганизмов, – количество случаев заболеваний без нарушений баланса микрофлоры, – численность населения без нарушений баланса микрофлоры, – количество населения с j-ой степенью нарушений баланса микрофлоры. Индивидуальный риск дополнительной заболеваемости для различных степеней нарушений баланса микрофлоры рассчитывается по соотношению:

(8)

где M – численность населения. Результаты расчетов дополнительной заболеваемости взрослого населения для различных степеней нарушений баланса микрофлоры представлены в таблице 5, численность взрослого населения модельного региона составляет 2172329 человек.

Таблица 5

Индивидуальный риск дополнительной заболеваемости для различных степеней нарушений баланса микрофлоры (взрослые)

  Таким образом, при возникновении дисбаланса кишечной микрофлоры у взрослого населения (в том числе обусловленного повышенной концентрацией тетрациклина) увеличивается риск патологических проявлений в виде заболеваний кишечника до уровня 0,003884. На фоне общей заболеваемости населения болезнями системы пищеварения (33,6 сл./1000 в РФ в 2010 г.) с учетом доли населения, чувствительной к действию тетрациклина (70%) увеличение заболеваемости может составить 23% случаев. Аналогичным образом рассчитан индивидуальный риск дополнительной заболеваемости для детского населения. Частота нарушений баланса микрофлоры, случаи заболеваний и индивидуальный риск для детского населения представлены в таблицах 4-6, численность детского населения модельного региона составляет 439673 человек.

Таблица 6

Частота нарушений баланса микрофлоры кишечника при различных заболеваниях (дети),%

Группа (код МКБ10)	Нарушение баланса
	Отсутствие нарушений	1 степень	2 степень	3 степень
СРК с диареей (K58.0)	0	22,2	66,7	11,1
Запор (K59.0)	0	74,0	26,0	0
Функциональное нарушение кишечника неуточненное (K59.9)	0 %	15,0	84,0	1,0
Железодефицитная анемия (D50)	0 %	39,8	46,6	13,6
Другие атопические дерматиты (L20.8)	0	40,6	37,2 %	22,2
Дуоденит (K29.8, K29.9)	26,7	31,5	33,7	8,1
Пищевая аллергия (T78.0, T78.1, T78.4)	1,4	12,6	46,9	39,1
Общий вариабельный иммунодефицит неуточненный (D83.9)	0	2,0 %	80,0	18,0

Таблица 7

Случаи заболеваний кишечника в модельном регионе Российской Федерации (дети)

 

Таблица 8

Индивидуальный риск дополнительной заболеваемости для различных степеней нарушений баланса микрофлоры (дети)

  Таким образом, при возникновении дисбаланса кишечной микрофлоры у детского населения (в том числе обусловленного остаточными концентрациями тетрациклина в пищевых продуктах более 0,01 мг/кг) увеличивается риск патологических проявлений в виде заболеваний кишечника до уровня 0,000016?0,000461, дерматитов – 0,000206-0,000725, пищевой аллергии – 0,000012-0,000149, болезней крови – 0,000010-0,001372. На фоне общей заболеваемости детского населения болезнями системы пищеварения (85,07 сл./1000 в РФ в 2010 г.) с учетом доли населения, чувствительной к действию тетрациклина (70%) увеличение заболеваемости может составить 4% случаев, на фоне общей заболеваемости болезнями крови (18,35 сл./1000 в РФ в 2010 г.) – 8% случаев, на фоне общей заболеваемости болезнями кожи (93,21 сл./1000 в РФ в 2010 г.) – 0,9% случаев, на фоне общей заболеваемости по классу травм и отравлений, за счет дополнительного риска пищевой аллергии (108,04 сл./1000 в РФ в 2010 г.) – 0,1% случаев.