Антибиотики

Антибиотики обеспечивают большие прибыли животноводам и фармкомпаниям.

Животноводы давно не скрывают, что применяют антибиотики при производстве мяса, хотя медики уже в течение многих лет предупреждают, что их наличие в пище может подорвать здоровье человека. Однако в применении препаратов кровно заинтересованы как животноводческие хозяйства, так и фармацевтические компании.

Когда в 40-х годах прошлого столетия в обиход вошел термин «антибиотик», это была настоящая революция в медицине. Многие болезни и тяжелые ранения, долгие века считавшиеся смертельными, отныне успешно вылечивались. Потом антибиотиками начали потчевать и животных, добавляя препараты в корм. Вскоре выяснилось, что, кроме целебного эффекта, эти лекарственные средства позитивно влияют на рост скотины — коровы, куры, свиньи быстрее набирают вес. Однако тот факт, что применение фармпрепаратов в сельском хозяйстве самым негативным образом влияет на здоровье человека, вырабатывая в организме резистентность к антибиотикам, долгое время не предавался огласке. Сегодня Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует максимально снизить применение антибиотиков в животноводстве. Но пока к ее советам прислушались лишь в Евросоюзе. США, Китай и Россия продолжают пичкать животных, а заодно и нас с вами лекарствами.
Исторические хроники

Кормовые антибиотики (стимуляторы роста) улучшают усвояемость пищи, увеличивают прирост веса до 50% за счет улучшения аппетита и более полного использования питательных веществ корма. Двухмесячные поросята, получающие корм с антибиотиками, весят на 1,5—1,7 кг больше своих собратьев, потребляющих «чистую» пищу. На каждую тысячу животных, получающих кормовые антибиотики, производитель имеет дополнительно 100—120 ц свинины. Соответственно расходы кормов сокращаются, производительность увеличивается, растут доходы животноводов. К тому же антибиотики снижают падеж молодняка. «Сегодня обычная выживаемость цыплят на российских птицефабриках, которые не применяют антибиотики, составляет 92—93%. Причем 90-процентная выживаемость дает возможность окупить расходы, а 2—3% — это прибыль птицефабрики от одного производственного цикла (до забоя цыпленка выращивают 45 дней). В году семь циклов, соответственно, прибыль составляет 14% в год. Если применять антибиотики, то можно добиться 97—98% выживаемости, повысив прибыль в два-три раза, то есть до 50—55%», — подсчитывает председатель совета директоров ЗАО «Моссельпром» Сергей Лисовский.

Первыми добавлять антибиотики в корма стали американские фермеры в 50-е годы прошлого века с целью интенсифицировать производство. Коров и кур больше не выпускали пастись на полях и лужайках, а держали в тесных загонах. В таких условиях повышалась вероятность развития инфекционных заболеваний, но с недугами теперь легко можно было справиться с помощью антибиотиков. Смущал лишь один нюанс: вместе с пищей — мясом, молоком, яйцами — лекарства отныне попадали в человеческий организм. А ведь антибиотики подавляют жизнедеятельность не только вредных, но и полезных микробов. «В 1960—1970-х годах тысячи госпитализированных американцев и десятки тысяч жителей Центральной и Латинской Америки умерли в результате инфекций (гонореи, пневмонии, детского менингита, брюшного тифа и сальмонеллеза), устойчивых к антибиотикам», — говорилось в отчете американских ученых, опубликованном еще в 1980 году. Тем не менее примеру американцев последовали европейские фермеры, а затем и советские колхозы и совхозы, которые с помощью антибиотиков могли частично решить перманентную проблему нехватки кормов.

Медики утверждают, что особенно опасно использование одних и тех же антибиотиков в животноводстве и в медицине. «Антибиотики, попадающие в организм человека с пищевыми продуктами, угнетают его микрофлору. Снижается иммунитет, возрастает восприимчивость к различным инфекциям», — объясняет Виктор Тутельян, директор НИИ питания Российской академии медицинских наук, академик РАМН. Вылечить такие заболевания бывает очень трудно, поскольку организм становится невосприимчивым к лечебному действию препаратов, которые прописывает врач. Угнетение иммунитета также способствует развитию различных видов аллергий. «На фоне снижения иммунитета и риска развития аллергических реакций могут возникнуть любые аутоиммунные заболевания. Кроме того, если человек регулярно питается продуктами, содержащими антибиотики, то перегружаются печень и почки, которые отвечают за выведение любых чужеродных веществ. Соответственно повышается риск развития хронических заболеваний. Снижение иммунитета провоцирует все эти состояния, а устойчивость к препаратам осложняет процесс лечения», — добавляет врач-диетолог Лидия Ионова, руководитель «Клиники доктора Ионовой».

Пищевые противоречия

Правительства многих стран оказались перед сложным выбором. С одной стороны, необходимо ограничить применение антибиотиков в сельском хозяйстве и тем самым защитить здоровье населения. Но это благое намерение входит в жесткое противоречие с планами фермеров и фармкомпаний, которые вовсе не хотят поступаться своими прибылями. Британский писатель Джонатан Коу в романе «Какое надувательство!» точно описал проблему. Одна из героинь книги, Дороти, превратила доставшуюся ей в наследство ферму в доходное промышленное предприятие, в том числе благодаря использованию антибиотиков. Дороти, не обремененная нравственными вопросами, крайне озабочена тем, что некоторые препараты могут запретить для применения в животноводстве, и просит своего брата-сенатора повлиять на ситуацию:

«— Из Штатов доходят какие-то ужасные слухи. Ты знаешь о лекарстве сульфадимидин?

— Не припоминаю, а что оно делает?

— В свиноводстве незаменимо. Абсолютно незаменимо. Насколько тебе известно, за последние 20 лет мы неимоверно повысили уровень производства, но возникла парочка побочных эффектов. Заболевания дыхательных путей, например. Сульфадимидин может излечить некоторые самые острые, понимаешь?

— Так в чем проблема?

— О, американцы испытали его на крысах и пришли к выводу, что препарат — возможный канцероген. Теперь его, очевидно, запретят.

— Гм. Что-нибудь другое нельзя применить?

— Это самое эффективное. Не спорю, мы могли бы, наверное, сократить заболеваемость, разводя скот менее интенсивно…

— Ох, но это же абсурд. Нет никакого смысла ломать то, что делает нас конкурентоспособными. Я поговорю с министром. Уверен, он разделит твою точку зрения. В любом случае тесты на крысах ничего не значат. А кроме того, нам и раньше удавалось игнорировать мнения независимых консультантов, а это само по себе достойно уважения».

Кстати, именно Великобритания еще в 1971 году первая среди европейских стран запретила использование в качестве кормовых антибиотиков препараты, которые применяются при лечении человека. В 1986 году Швеция наложила запрет на стимуляторы роста, в 1998 году к ней присоединилась Дания. В 2000 году ВОЗ провела исследования, которые подтвердили негативный эффект от применения антибиотиков в животноводстве. ВОЗ рекомендовала прекратить или резко снизить использование для стимуляции роста тех средств, которые могут применяться для лечения людей, а также создать жесткую систему контроля за оборотом антибиотиков в сельском хозяйстве. В 2006 году Евросоюз заявил об отказе от кормовых антибиотиков в животноводстве (для лечения скота лекарства использовать можно). «Запрет на государственном уровне — это политическое решение. Руководство Евросоюза считает вред от антибиотиков реальной политической угрозой, связанной с повышением заболеваемости и смертности, которые превышают коммерческую выгоду от применения этих медикаментов», — комментирует Павел Толстых, руководитель Центра по изучению проблем взаимодействия бизнеса и власти. Однако на деле отказаться от стимуляторов роста не удалось.

Инициаторы запрета полагали, что в Европе коровы, свиньи и птицы прошли такой жесткий селекционный отбор, что их генетика позволит справляться с вредными микроорганизмами без всяких антибиотиков. «Вместо антибиотиков планировалось применять дешевые и эффективные препараты. Менялся сам подход к лечению животных. Вместо уничтожения болезнетворных микроорганизмов антибиотиками животных начали кормить пробиотиками, они способствуют повышению иммунитета, который должен помочь организму самостоятельно справиться с болезнями. Однако пробиотики значительно дороже и к тому же менее эффективны, чем антибиотики. Об этом можно судить хотя бы по тому, что огромные продажи обогащенных пробиотиками кисломолочных продуктов не привели к существенному спаду заболеваемости гриппом и ОРВИ», — рассказывает Владимир Авдеенко, генеральный директор исследовательской компании Abercade.

Тогда европейцы сделали упор на создание идеальных условий содержания скота. «Животные не контактируют друг с другом, работники носят спецодежду, они не должны чихать и кашлять. Однако даже в таких условиях обойтись без кормовых антибиотиков невозможно, поэтому в Европе сейчас практикуется применение так называемых лечебных кормов — пищи с добавлением антибиотиков, правда, на достаточно короткий период времени», — рассказывает Элла Васильева, главный эксперт по племенному делу Национального союза свиноводов. «Зарубежные исследователи говорят о том, что когда фермеры отказались от кормовых антибиотиков, то увеличилось употребление антибиотиков в лечебных целях», — продолжает Иван Егоров, заместитель директора по селекционной работе Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства, академик Российской академии сельскохозяйственных наук.
Национальные особенности

В отличие от стран ЕС в России не запрещено применять кормовые антибиотики в животноводстве. Но их использование жестко регулируется (см. справку). «Речь идет о шести видах лекарств, которые широко распространены и в животноводстве, и в медицине. Это хлорамфеникол (левомицетин), тетрациклин, стрептомицин, пенициллин, гризин, бацитроцин. Для лечения и профилактики заболеваемости птицы и мясных пород скота используют левомецитин, тетрациклин, гризин, бацитроцин, для молочных пород — левомецитин, тетрациклин, стрептомицин, пенициллин. Согласно российскому законодательству, эти антибиотики не должны выявляться при проверках всех видов мяса, жира, яиц, молока», — рассказывает Наталья Ефимочкина, ведущий научный сотрудник НИИ питаниям РАМН. Правда, это вовсе не означает, что антибиотиков в мясе и молоке нет совсем. Просто их содержание должно быть ниже чувствительности метода. Например, если прибор измеряет с точностью до 0,05 мг/кг, то содержание в 0,04 мг/кг он уже не обнаружит, и продукт признается годным.

«Еще примерно десять антибиотиков контролируются, только если производитель заявляет о том, что применяет эти препараты. Максимальные уровни остатков регламентированы СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продук­тов». Например, гентамицина в мясе, жире коров и свиней может содержаться не более 0,1 мг/кг, в печени — 2 мг/кг, почках — 5 мг/кг, в молоке — 0,2 мг/кг, неомицина в мясе, жире, молоке коров — 0,5 мг/кг, в печени — 15 мг/кг, в почках — 20 мг/кг. Гентамицин применяется для лечения дыхательных путей человека, менингита и различных инфекций кожи и слизистой оболочки, неомицин — для лечения инфекций кожи. Если производитель применял антибиотики и не заявил об этом, то это прямое нарушение закона», — добавляет Наталья Ефимочкина. Впрочем, не исключено, что таких нарушителей закона в нашей стране немало.

Теоретически наши способы контроля не отличаются от европейских. Но российское животноводство ничем не отличается от многих других отраслей отечественного хозяйства, где самым жестким нормам всегда противостоит очень слабый контроль. «Антибиотики дают возможность быстро и дешево получить прибыль. Поэтому производители добровольно от них не откажутся. Нужно, чтобы ветеринарный надзор обращал более пристальное внимание на качество мяса, тогда производитель будет искать другие пути для стимулирования роста животных, сохранности молодняка. Пока контроль жесткий только на словах», — говорит Элла Васильева.

А пока ничего не остается, кроме как рассчитывать на сознательность производителей. «Современное птицеводство — достаточно молодая отрасль, оснащенная новым оборудованием. На хороших птицефабриках и без антибиотиков выживаемость составляет 94—95%. К тому же от антибиотиков ухудшается вкус и текстура мяса. Поэтому в основном используем традиционные методы, например, поим цыплят марганцовкой. А антибиотики применяем только для лечения инфекций, но за десять дней до забоя обязательно прекращаем, поскольку именно столько времени нужно для выведения лекарства из организма птицы», — уверяет Сергей Лисовский. По его мнению, в России 80% птицефабрик, которые в своей работе антибиотиками не пользуются. В то же время, например, в методическом пособии Кемеровского технологического института пищевой промышленности говорится: «Остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в 15—26% продукции животноводства и птицеводства. Обращает внимание большой уровень загрязнения левомицетином — одним из наиболее опасных антибиотиков». Даже при слабом контроле цифра довольно внушительная.

Если заболела одна корова, то лекарствами кормят все стадо. Поэтому в России, как и в Европе, проблема должна решаться за счет улучшения условий содержания. Однако этим в нашей стране могут похвастаться немногие животноводческие комплексы. Кроме того, из-за плохой генетики собственных животных в Россию активно завозится племенной крупный рогатый скот из-за рубежа, а вместе с ним «приезжают» бактерии, которые надо изводить лекарствами.

Могут ли российские и мировые производители мяса совсем обойтись без фармакологических препаратов? «Сегодня возделывают растения, экстракты которых обладают антимикробным действием: розмарин, душицу, лук, чеснок, перец, эхинацею, календулу. Но применение этих растений намного дороже антибиотиков, ведь нужно поднять новую отрасль — выращивание специальных кормов. К тому же еще не до конца ясен механизм действия этих пробиотиков, пребиотиков, фитобиотиков», — делится своими мыслями Иван Егоров. Сейчас кормовые антибиотики стоят около 50—60 руб. на тонну корма, а пробиотики — 200—300 руб. на тонну корма. При отказе от антибиотиков растет падеж молодняка, соответственно сокращаются доходы производителей, но повысить отпускную цену они не могут. «Цены диктуют торговые сети, которым выгодно работать с более дешевой импортной курятиной, а европейские фермеры могут снижать цены, поскольку получают экспортную субсидию 18 евроцентов на один килограмм при оптовой цене в России 65 рублей за килограмм», — поясняет Сергей Лисовский.

Ищи, кому выгодно

«Огромное количество кормовых и достаточно жестких антибиотиков, на которые наложено вето в Европе, поступает на российский рынок, потому что у нас их разрешено применять. Часто мы лечим животных теми препаратами, от которых Европа отказалась много лет назад. Например, сильный антибиотик тилан (предназначен для лечения и профилактики респираторных заболеваний животных) в очень редких случаях применяется в Европе, а к нам он завозится в огромных количествах», — рассказывает Элла Васильева. Антибиотики, которые 50 лет назад позволили животноводству интенсивно развиваться, теперь стали тормозом. «Отечественные хозяйства думают только о том, как бы сэкономить рубль, не понимая, что завтра придется вложить десять. Например, купят дешевые и плохие корма, а потом подсыпают антибиотики, чтобы стадо не подохло и кое-как набрало вес не за 150 дней (как при хорошем питании), а за 200 дней. А эти 50 дней животных нужно кормить, содержать и лечить. Если же купить хорошие корма, но подороже, создать нормальные условия, вовремя делать прививки, давать витамины, то и антибиотик понадобится только в случае болезни. Поросенок быстрее наберет вес и соответственно его быстрее можно будет продать и получить прибыль», — рассуждает Элла Васильева.

Ситуация с медикаментами в животноводстве сродни проблеме допинга в спорте. «Фермеры будут использовать антибиотики до тех пор, пока это возможно. Глобальные фармкомпании ищут новые рынки сбыта в странах с недостаточно развитой правовой культурой. Например, в Китае, где живет четверть населения планеты. В таких странах фармкомпании имеют возможность использовать свои финансовые и административные ресурсы, чтобы тормозить принятие документов, ограничивающих использование антибиотиков в соответствии с рекомендациями ВОЗ. В какой-то степени к таким странам относится и Россия», — говорит Павел Толстых. Нельзя исключить, что фармкомпаниям выгодно, чтобы у людей формировалась устойчивость к антибиотикам, поскольку тогда будут востребованы другие более сильные препараты для лечения заболеваний, а значит, прибыли производителей медикаментов буду расти. В 2009 году, по данным Associated Press, фермерские организации и фармацевтические компании истратили 70 млн долларов и 135 млн долларов на лоббирование своих интересов.

Сегодня списки запрещенных антибиотиков используются как инструмент политических игр. Например, в 2008 году в молочных продуктах, поступающих в Россию с четырех литовских заводов, неожиданно выявили следы тетрациклина, поставки продукции были прекращены до тех пор, пока молоко и сметана не будут соответствовать российским нормам. На самом деле молоко «обменяли» на низкие железнодорожные тарифы для доставки новолипецкого и оскольского чугуна и стали в Калининградскую область. Осенью 2009 года Россельхознадзор приостановил импорт мяса птицы с ряда заводов Германии и Голландии, тоже обнаружив тетрациклин, окситетрациклин и доксициклин (хотя в ЕС их применять нельзя), а также молдавского сухого молока, в котором оказались тетрациклин и окситетрациклин. Надзорные органы неоднократно запрещали ввоз курицы из США в связи с наличием в нем тетрациклина (большинство этих случаев не афишируются по политическим соображениям). В свое время Россия пыталась «обменять» куриные окорочка на вступление в ВТО. «Поскольку американскую курятину невозможно избавить от остатков тетрациклина (антибиотики являются основой птицеводства в США), то поступающую к нам курицу надзорные органы не проверяют. Чтобы не выявлять в них вредные препараты», — рассказал один из представителей птицеводческой отрасли.

Пока в животноводстве нет полноценной замены антибиотикам, фармкомпании будут до последнего навязывать фермерам противомикробные препараты, обеспечивающие баснословные прибыли (продвигая антибиотики, фармкомпании уверяют, что медикаменты практически без остатка выводятся из организма животных в течение нескольких дней). Поэтому мы еще долго будем питаться лекарствами вместе с мясом, молоком, яйцами. Единственная альтернатива этому — обзавестись собственным хозяйством и заняться разведением какой-нибудь живности.

Панацея

Антибиотики — химические вещества, вырабатываемые живыми микроорганизмами, обладающие способностью подавлять размножение или разрушать клетки бактерий, грибов и опухолей. Антибиотики оказывают антимикробное действие в очень малых дозах, имеют широкий спектр противомикробного применения, могут избирательно подавлять развитие тех или иных вредных микроорганизмов. Однако микроорганизмы, на которые воздействуют антибиотики, вырабатывают устойчивость (резистентность) к ним. Поэтому для дальнейшего антимикробного эффекта требуется применять все большие дозы или более сильные антибиотики. Как писал Пабло Неруда, «ученые придумали много лекарств, убили миллиарды микробов, но оставшиеся сотни стали в миллион раз злее».
В мире

По данным американского агентства Associated Press, в 2008 году в США было использовано около 15 млн килограммов антибиотиков. Из них 70% — в животноводстве. Всего в мире на животноводство приходится 50% всех произведенных антибиотиков. Американские куры и свиньи ежегодно съедают на 8% больше антибиотиков. В 2008 году 13% антибиотиков для стимуляции роста съели здоровые животные.

В Китае антибиотики используются наиболее активно, что позволяет реализовать политику партии по обеспечению внутреннего рынка собственным мясом и молоком. В Австралии стимуляторы роста применяются достаточно широко, за исключением препарата авопарцина. В Бразилии разрешено большинство кормовых антибиотиков — тетрациклин, пенициллин, хлорамфеникол. В Канаде кормовые антибиотики используют 90% свиноводов. В США запрещены лишь некоторые антибиотики, например хлорамфеникол. В то же время там активно применяется тетрациклин, поскольку американские врачи его давно не используют в своей практике, и считается, что этот препарат не может повлиять на здоровье человека через продукты. Российские медики, напротив, тетрациклин активно назначают. В принципе почти в каждой стране выбор антибиотиков, разрешенных или запрещенных в животноводстве, зависит от медицинской практики. Между тем любой врач знает, что сам по себе факт регулярного поступления любых антибиотиков в организм (даже с пищей) угнетает иммунную систему человека.

В России

По данным Research.Techart, в России животные ежегодно употребляют около 3,5 тыс. тонн антибиотиков. Из них 23% — для лечения и профилактики, 19% — в качестве стимуляторов роста, 36% —как противопаразитарные препараты, 22% — как профилактические средства. По данным исследовательской компании Abercade, в 2009 году объем рынка антибиотиков для животноводства в России составил 53,713 млн долларов, в том числе 46,408 млн долларов (86%) пришлось на лечебные антибиотики и 7,306 млн долларов (14%) — на кормовые. Большая часть антибиотиков поставляется из-за рубежа — 42,885 млн долларов (80%). За последние годы, с 2005 по 2009 год, российский рынок антибиотиков вырос в 2,3 раза. Крупнейшие поставщики препаратов в нашу страну — CEVA Group, Invesa Group, KRKA D.D., Pfizer Animal Health. Компания Pfizer Animal Health с 2005 по 2009 год увеличила поставки антибиотиков в Россию в 11 раз (с 450 тыс. до 5,005 млн долларов).

Меню

В российском животноводстве применяются антибиотики, которые контролируются в обязательном порядке:

хлорамфеникол (левомецитин), он же используется в медицине для лечения дизентерии, бруцеллеза, трахомы, пневмонии, менингита, сепсиса, остеомиелита, фурункулов, ожогов II и III степени, трещины сосков у кормящих женщин;

тетрациклин, также им лечат пневмонию, бронхит, хлами­дийные и глазные инфекции, сибирскую язву, чуму, тиф;

стрептомицин используют для лечения первичного туберкулеза, кишечных инфекций, инфекции мочевыводящих путей;

пенициллин эффективен при лечении пневмонии, бронхита, сепсиса, перитонита, менингита, инфекций мочеполовой системы, желчевыводящих путей, кожи, дифтерии, скарлатины и др.;

гризин и бацитроцин — кормовые антибиотики, которые в медицине не применяются.

Автор: Инга Токманцева, журнал Однако

Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства (утв. Минздравом СССР 29.06.1984 n 3049-84)
Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
29 июня 1984 г. N 3049-84
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ
В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА
В целях дальнейшей интенсификации животноводства и птицеводства, повышения производства мяса и других продуктов животного происхождения в сельском хозяйстве нашей страны применяются антибиотики для стимуляции роста, повышения эффективности откорма скота и птицы, а также в качестве лечебно-профилактических средств. Среди них препараты, содержащие тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, немедицинские антибиотики: гризин, цинкбацитрацин и прочие.
Условия применения антибиотиков для выращивания, откорма и лечения сельскохозяйственных животных и птицы регламентированы Инструкцией, утвержденной МСХ СССР в 1980 г., и Методическими указаниями по применению антибиотиков в ветеринарии (М., 1973), соблюдение которых должно гарантировать безопасность для здоровья населения продуктов, полученных от леченных или стимулированных антибиотиками животных. Однако в силу различных причин в пищевых продуктах, полученных от этих животных, в ряде случаев содержатся остатки антибиотиков.
Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина и др. обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Присутствие немедицинских антибиотиков (гризина и пр.) отмечено при включении в корма в экспериментальных условиях в превышенных количествах этих препаратов. Материалы научных исследований свидетельствуют о наличии остаточных количеств антибиотиков в мясных, молочных продуктах, яйцах. Вместе с тем длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может вызвать неблагоприятные для здоровья человека последствия – аллергические реакции, дисбактериоз, образование и передачу резистентных форм микробов. Экспериментально установленные при этом уровни неблагоприятного действия антибиотиков на организм позволили обосновать величины максимально допустимого суточного поступления их в организм человека с продуктами питания и сделать вывод, что при санитарном контроле продуктов питания остаточные количества антибиотиков в них не должны допускаться при использовании предлагаемых ниже утвержденных методов исследования в пределах их чувствительности (для хлортетрациклина, пенициллина – 0,01, стрептомицина – 0,5, гризина и цинкбацитрина – 0,1 и 0,002 ЕД на г/мл продукта).
Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания антибиотиков должно осуществляться путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб молока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них антибиотиков. Необходимо выявлять хозяйства, поставляющие пищевые продукты, загрязненные антибиотиками, выявлять причины попадания в них антибиотиков и принимать меры для устранения этих нарушений, не допускать снабжения пищевыми продуктами, содержащими остаточные количества антибиотиков, детских учреждений, больниц и т.п.
Реализация молока с наличием остаточных количеств антибиотиков решается в каждом конкретном случае представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора.
Молоко, содержащее остаточные количества любых антибиотиков, может использоваться в качестве дополнительного кормового средства при откорме молодняка сельскохозяйственных животных.
Творог, сметану, яйца, содержащие остаточные количества антибиотиков тетрациклинового ряда, пенициллина, следует направлять на изготовление хлебобулочных и кондитерских изделий с расчетом, чтобы соотношение “загрязненных продуктов” с другими компонентами изделий было не меньшим, чем 1:4 (при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,05 ЕД/г), 1:10 и 1:100 – при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,1 ЕД/г и до 1,0 ЕД/г и более, соответственно.
Мясо и субпродукты, содержащие остаточные количества антибиотиков, не следует в необработанном виде реализовывать населению. Такое мясо должно направляться на изготовление мясных, мясо-растительных консервов, за исключением консервов для детского питания, концентратов I и II блюд, вареных и варено-копченых колбас при условии обязательной подсортировки к мясу или компонентам блюд, не содержащих остаточных количеств антибиотиков. Среднерасчетная кратность разведения “загрязненного” антибиотиками мяса незагрязненным должна составлять 17 (по данным Института питания АМН СССР). В каждом конкретном случае вопрос о реализации и использовании мяса с наличием остаточных количеств антибиотиков решается представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора с условием, что при подсортировке кратность соотношения “загрязненных” и незагрязненных продуктов должна зависеть от выявленной концентрации антибиотика, с тем, чтобы в конечном итоге содержание остаточного количества антибиотика было ниже уровня чувствительности утвержденных методов исследования.
Например, в образцах мышечной ткани от говяжьей туши N “__”, поступившей на забой из с-х “…-ский”, выявлено содержание хлортетрациклина на уровне 0,2 ЕД/г. Следовательно, чтобы содержание антибиотика в продукте снизилось до менее 0,01 ЕД/г, мясо от этой туши должно быть направлено на приготовление колбас при условии введения в фарш в размере не более 5% к общей массе продукта. В совхоз должно быть направлено предписание о нарушении инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии или при откорме животных, а к руководителю хозяйства приняты административные меры.
При реализации продуктов питания, содержащих остаточные количества стрептомицина, гризина, цинкбацитрацина, должен использоваться такой же подход подсортировки к незагрязненному антибиотиками сырью с учетом выявленной концентрации антибиотика и соответствующей кратностью разведения.
Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением антибиотиков в животноводстве и ветеринарии и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью чувствительных методов.
В целях систематического контроля в стране за загрязнением продуктов животноводства антибиотиками предлагаются данные “Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства”. Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях, нашли микробиологические методы, позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому наиболее специфичны и объективны. Ниже рекомендуются методы определения некоторых антибиотиков:
а) тетрациклиновой группы – в молоке, молочных продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, в т.ч. мясе и субпродуктах птицы;
б) стрептомицина – в молоке и молочных продуктах, яйцах;
в) пенициллина – в молоке и молочных продуктах;
г) гризина – в мясе;
д) цинкбацитрацина – в мясе.
Содержание антибиотиков выявляют микробиологическим методом диффузии в агар по величине торможения роста следующих тест-культур, внесенных в питательные среды:
– для тетрациклиновых антибиотиков – Bac. cereus АТСС 11778 (чувствительность – 0,01 ЕД/г/мл);
– для стрепомицина – Bac. mycoidis 537 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);
– для пенициллина – S. lutea АТСС 9341 (чувст. 0,01 ЕД/г/мл);
– для гризина – Bac. cubtilis АТСС 6633 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);
– для цинкбацитрацина – M. flavus АТСС 10240 (чувст. 0,02 ЕД/г/мл).
Молоко рекомендуется исследовать на присутствие остаточных количеств антибиотиков в том случае, когда при предварительном исследовании по ГОСТ 23454-79 в нем обнаружены ингибирующие вещества и исключено наличие химических веществ.
ОТБОР ПРОБ, САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ И ОТЧЕТНОСТЬ
Отбор проб молока и молочных продуктов производится по ГОСТ 13928-68 и 9225-68, но не более 50 мл каждой пробы; мяса и мясных продуктов – по ГОСТ 7269-79, но не более 50 г каждой пробы; яйца отбирают в пределах 0,5 – 1% (в зависимости от объема партии).
Санитарный контроль за содержанием антибиотиков в молочных, мясных продуктах, яйцах следует проводить не реже 1 раза в квартал. Количество проб для анализа и перечень антибиотиков определяют в зависимости от состояния вопроса в каждой местности. Органы ветнадзора должны информировать санитарно-эпидемиологическую службу о применяемых в данном районе, области в животноводческих хозяйствах антибиотиках в качестве кормовых или лечебных препаратов.
В случае обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах необходимо применять административные меры к руководителям хозяйств за нарушение Инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии и при выращивании скота. Врачам по гигиене питания, специалистам ведомственной санитарной службы, ветнадзора следует проводить разъяснительную работу о недопустимости загрязнения пищевых продуктов остаточными количествами антибиотиков.
Материалы по результатам исследований продуктов животноводства на загрязнение антибиотиками в целом по району, области, республике должны ежегодно обобщаться и анализироваться в целях принятия конкретных профилактических мер.
1. АППАРАТУРА
1. Автоклав (стерилизатор паровой), ГОСТ 19569-74.
2. Бумага масштабно-координатная марки ПЛН, ГОСТ 334-73 (полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков).
3. Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г, ТУ 25.06.1131-75.
4. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом
-3
взвешивания 1 x 10 – 0,2 кг по ГОСТу 24104-80.
5. Водяная баня лабораторная (аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42.1091-63).
6. Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090-74.
7. Ионометр универсальный (pH-метр) ЭВ-74.
8. Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000 куб. см по ГОСТу 10394-72.
9. Линейка по ГОСТу 17435-72.
10. Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 куб. см.
11. Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 куб. см по ГОСТу 23932-79.
12. Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284-78.
13. Микроразмельчитель тканей типа РТ-2, МРТУ 04.1.1505-63 (или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147-73 и кварцевый песок).
14. Ножницы по ГОСТу 21239-77; скальпель, ГОСТ 21240-77; пинцеты по ГОСТу 31241-77.
15. Палочки стеклянные.
16. Петля бактериологическая.
17. Пробочное сверло 9 мм.
18. Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 куб. см по ГОСТу 20292-74.
19. Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932-79.
20. Пробирки центрифужные емкостью 10 куб. см.
21. Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.
22. Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.
23. Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878-60.
24. Трафарет для вырезания лунок.
25. Уровень для установления горизонтальной поверхности.
26. Холодильник бытовой по ГОСТу 16317-70.
27. Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107-71; центрифуга настольная ЦЛН-2, МРТУ 421742-63.
28. Цилиндры мерные на 50, 100, 250, 1000 куб. см по ГОСТу 1770-74.
29. Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932-79, а также чашки из полимерных материалов.
30. Штативы для пробирок на 20 – 40 гнезд по ТУ 64-1-2669-78.
2. КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
1. Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206-71.
2. Мясо-пептонный бульон по ГОСТу 20730-75.
3. Дрожжевой экстракт (экстракт кормовых дрожжей сухой, производство МНИИВС).
4. Мясная вода по ГОСТу 20729-75.
5. Панкреатический гидролизат казеина.
6. Пепоин медицинский.
7. Пептон сухой ферментативный, ГОСТ 13805-76.
8. Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130 – 140 мг% по ГОСТу 10444.1-75.
3. РЕАКТИВЫ
1. Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975-75.
2. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
3. Натрия гидрат окиси (натр едкий), ГОСТ 4328-66, 10% р-р.
4. Натрий лимоннокислый, х.ч., ГОСТ 22280-76.
5. Калия фосфат однозамещенный, х.ч., ГОСТ 4198-65.
6. Калия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 2493-65.
7. Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 11773-66.
8. Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67.
9. Кислота соляная, х.ч., уд. вес 1,18 – 1,19.
10. Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233-77.
11. Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
4. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Среда N 1
Дистиллированная вода – 10,0 мл Стерилизация автокла-
Агар-агар – 6,0 г +/- 0,1 вированием при 121
pH среды – 8,0 град. C +/- 1 град. C
20 мин. +/- 3 мин.
Среда N 2
Пептон – 10,0 г Стерилизация автокла-
Хлористый натрий – 5,0 г вированием при 121
Агар-агар – 20,0 г град. C +/- 1 град. C
Мясная вода 1:2 – до 1000 мл 20 мин. +/- 3 мин.
pH среды – 7,0 +/- 0,1
Среда N 3
Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 100 мг% – 1000 мл
Агар-агар 20,0 +/- 0,1
Глюкоза (добавляют в расплавленный агар 40% глюкозу в количестве
2,5 мл на 100 мл среды)
pH среды после стерилизации 6,4 +/- 0,1 Стерилизация автокла-
вированием при 121
град. C +/- 1 град. C
20 мин. +/- 3 мин.
Среда N 4
Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% – 1000 мл
Агар-агар – 25,0 +/- 0,1 г Стерилизация автокла-
pH среды – 6,1 +/- 0,1 вированием при 121
град. C +/- 1 град. C
20 мин. +/- 3 мин.
Среда N 5
Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% – 1000 мл
Агар-агар – 20,0 +/- 0,1 г Стерилизация автокла-
NaHPO4 – 2,5 +/- 0,05 г вированием при 121
pH среды – 7,9 +/- 0,1 град. C +/- 1 град. C
20 мин. +/- 3 мин.
Среда N 6
Пептон – 10,0 +/- 0,1 г Стерилизация автокла-
Натрий хлористый – 5,0 +/- 0,05 г вированием при 121
Агар-агар – 20,0 +/- 0,1 г град. C +/- 1 град. C
Мясная вода 1:2 – до 1000 мл 20 мин. +/- 3 мин.
pH среды – 6,5 +/- 0,1
Среда N 7
Пептон – 6,0 +/- 0,1 г
Панкреатический гидролизат казеина сухой – 4,0 +/- 0,05 г (или
40,0 +/- 1 мл жидкого)
Дрожжевой экстракт сухой – 3,0 +/- 0,05 г (или 30,0 +/- 1 мл
жидкого)
Мясной экстракт сухой – 1,5 +/- 0,01 г (или 15,0 +/- 0,5 мл мясной
воды)
Глюкоза – 1,0 +/- 0,01 г Стерилизация автокла-
Агар-агар – 20,0 +/- 0,1 г вированием при 115
Вода дистиллированная – до 1000 мл град. C +/- 3 град. C
pH среды – 6,5 +/- 0,1 20 мин. +/- 3 мин.
Среда N 8
Мясная вода 1:2 – 500 +/- 1 мл Стерилизация автокла-
Пептон – 5,0 +/- 0,05 г вированием при 121
Хлористый натрий – 2,5 г град. C +/- 1 град. C
Фосфат калия двухзамещенный – 3,0 г 20 мин. +/- 3 мин.
Агар-агар – 6,0
Вода дистиллированная – до 1000 мл
pH среды – 7,8 – 8,0
5. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ
АНТИБИОТИКОВ ИЗ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
1. Физиологический раствор Стерилизация автокла-
NaCl – 8,5 г вированием при 121
H2O – до 1л град. C +/- 1 град. С
20 мин. +/- 3 мин.
2. Цитратно-солянокислый, pH 5,1 +/- 0,1 Стерилизация автокла-
лимоннокислый натрий – 20,6 г вированием при 121
HCl, уд. вес 1,19 – 1,81 мл град. C +/- 1 град. C
H2O – до 1 мл 20 мин. +/- 3 мин.
3. 2% раствор пепсина на цитратно-солянокислом буфере с pH 5,1
+/- 0,1
пепсин медицинский – 2 г (Асептично взвешенную
буфер – 100 мл навеску пепсина вносят
в стерильный буфер
перед проведением
анализа)
4. Фосфатный буфер pH 6,0
KH2PO4 – 7,72 г или KH2PO4 – 2 г Стерилизация автокла-
NaHPO4 – 1,78 г K2HPO4 – 8 г вированием при 121
H2O – до 1 л H2O – до 1 л град C +/- 1 град. C
20 мин. +/- 3 мин.
5. 2% раствор пепсина на фосфатном буфере с pH 6,0
пепсин медицинский – 2 г (Асептично взвешенную
буфер – 100 мл навеску пепсина вносят
в стерильный буфер
перед проведением
анализа)
6. Фосфатный буфер pH 7,9 +/- 0,1
K2HPO4 – 16,73 г Стерилизация автокла-
KH2PO4 – 0,523 г вированием при 121
H2O – до 1 л град. C +/- 1 град. C
20 мин. +/- 3 мин.
7. Цитратно-солянокислый, pH 3,1 +/- 0,1
I раствор – 22,6 г лимоннокислого натрия растворяют в 1 л воды;
II раствор – 8,2 мл конц. HCl с уд. весом 1,19 растворяют в 1 л
дистиллированной воды
Буфер готовят при смешивании двух растворов;
62 мл I раствора + 100 мл II раствора, pH буфера 3,0 +/- 0,1
Стерилизация – 121 град. C +/- 1 град. C 20 мин. +/- 3 мин.
6. ВЫРАЩИВАНИЕ ТЕСТ-КУЛЬТУР
И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ
Тест-культурами служат специально отобранные, образующие и необразующие споры, непатогенные или условно патогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотиков в агар.
6.1. Приготовление спор Bac. cereus ATCC 11778
Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 7,1 +/- 0,1) и выращивают при 29,0 +/- 1,0 град. C в течение 20,0 +/- 2,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 8,0 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 200 +/- 1,0 мл 2% МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30 град. C. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80 – 90% спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной воды. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65 – 70 град. C в течение 30,0 +/- 1,0 мин., трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин., каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до получения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,0 +/- 1,0 мин. при 65 – 70 град. C. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4 град. C и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.
6.2. Приготовление рабочей концентрации Bac. cereus
АТСС 11778
Небольшое количество (0,2 мл) споровой взвеси Bac. cereus
вносят в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического
раствора и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед.
8
полученную взвесь доводят до концентрации 5 x 10 микробных тел в
1 мл. Затем 0,2 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и
охлажденной до 60 град. C питательной среды. В итоге нагрузка тест
6
– культуры в питательной среде составляет 10 спор в 1 мл.
6.3. Выращивание спор Bac. mycoidis 537
Культуру пересевают на скошенный агар (2% МПА, среда N 2, pH 7,9 +/- 0,1) и выращивают при 37 град. C в течение 20 +/- 2,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,1 +/- 0,1 (среда N 4). Засеянные матрацы выдерживают при 37 град. C в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 85 +/- 5,0% спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.
Полученную взвесь спор прогревают при 65 – 70 град. C в течение 30 мин., а затем поступают так же, как и при получении спор Bac. cereus АТСС 11778, п. 6.1.
Таблица 1
ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ,
БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ, РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТОВ
АНТИБИОТИКОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
———–T————-T————-T———-T———T——T——–¬
¦Антибиотик¦Текст-микроб ¦Ориентировоч-¦Питатель- ¦Буферные ¦Кол-во¦Рабочая ¦
¦ ¦ ¦ная посевная ¦ные среды ¦растворы ¦среды ¦концент-¦
¦ ¦ ¦доза на 1 мл ¦ ¦ ¦ на ¦рация ¦
¦ ¦ ¦среды ¦ ¦ ¦чашку ¦стандар-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦та анти-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦биотика ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦в мкг/мл¦
+———-+————-+————-+———-+———+——+——–+
¦Тетрацик- ¦Bac. cereus ¦1 млн. спор ¦N 2, N 3 ¦N 2, N 3 ¦10 мл ¦0,05 ¦
¦лины ¦ATCC 11778 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Стрептоми-¦Bac. mycoidis¦20 млн. спор ¦N 2, N 4 ¦N 4, N 6 ¦10 мл ¦2,0 ¦
¦цин ¦537 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Пенициллин¦Sur. lutea ¦15 млн. ¦N 7 ¦N 4, N 5 ¦10 мл ¦0,05 ¦
¦ ¦ATCC 9341 ¦микробных тел¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Гризин ¦Bac. cubtilis¦5 млн. спор ¦N 5, N 6, ¦N 1, N 7 ¦10 ¦0,4 ¦
¦ ¦ATCC 6633 ¦ ¦N 8 ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Цинкбацит-¦M. flavus ¦10 млн. ¦N 6 ¦ ¦10 ¦0,1 ¦
¦рацин ¦ATCC 10240 ¦микробных тел¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L———-+————-+————-+———-+———+——+———
6.4. Приготовление рабочей концентрации
Bac. mycoidis 537
В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1 – 0,2 мл взвеси спор Bac. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед. разводят споры до 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60 град. C питательную среду из расчета 20 млн. спор в 1 мл среды, т.е. 2 мл 1 млрд. взвеси в 100 мл среды.
6.5. Выращивание S. lutea АТСС 9341
и приготовление микробной взвеси
Культуру выращивают в течение 20 +/- 2,0 час. в пробирках со средой N 7, после чего ее смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4 град. C. Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд. микробных тел так же, как и Bac. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 град. C питательную среду N 7 из расчета 30 млн. микробных тел на 1 мл среды, т.е. 3 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.
6.6. Выращивание спор Bac. cubtilis АТСС 6633
Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 6,5 +/- 0,1) и выращивают при 37 град. C в течение 18 – 20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,9 +/- 0,1 (среда N 5). Выращивают при 37 град. C в течение 7 суток, а затем поступают так же, как при получении спор Bac. cereus АТСС 11778.
6.7. Приготовление взвеси спор Bac. cubtilis АТСС 6633
В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды
добавляют небольшое количество (0,1 – 0,2 мл) споровой взвеси Bac.
cubtilis АТСС 6633 и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на
8
5 ед. полученную взвесь доводят до концентрации 5 x 10 спор в 1
мл. Затем 1 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и
охлажденной до 60 град. C +/- 1 град. C питательной среды.
6.8. Выращивание M. flavus АТСС 10240
Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6,5 +/- 0,1 (среда N 6). Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,5 +/- 0,1 при 37 град. C в течение 19 +/- 1,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд. микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 град. C питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.
7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ (РАБОЧИХ) КОНЦЕНТРАЦИЙ
СТАНДАРТНЫХ АНТИБИОТИКОВ
При определении остаточных количеств антибиотиков для приготовления контрольных концентраций используют стандарты антибиотиков, т.е. очищенные образцы препарата, содержащие строго определенное количество единиц действия в 1 мг.
7.1. Приготовление рабочей концентрации
хлортетрациклина (ХТЦ)
Произвольную навеску хлортетрациклина (5 – 15 мг) растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл кислоты) и получают основной раствор. Далее по схеме N 1 на буфере N 2 готовят контрольное разведение антибиотика. Пример. Стандарт ХТЦ содержит 930 ед./мг. Навеску в 10 +/- 0,0001 мг растворяют в 10 +/- 0,0001 мл 0,1 н HCl. Основной раствор содержит 930 ед./мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед./мл.
Схема N 1
—-T———————————————–T————¬
¦ N ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация¦
¦ ¦ ¦антибиотиков¦
¦ ¦ ¦ ед./мл ¦
+—+———————————————–+————+
¦ 1.¦1 мл основного раствора + 8,3 буфера pH 5,2 ¦ 100 ¦
¦ 2.¦1 мл раствора N 1 + 9 мл буфера pH 5,2 ¦ 10 ¦
¦ 3.¦0,1 мл р-ра N 2 + 9,9 мл -“- -“- ¦ 0,1 ¦
¦ 4.¦5 мл раствора N 3 + 5 мл -“- -“- ¦ 0,05 ¦
L—+———————————————–+————-
Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.
7.2. Приготовление контрольной концентрации
стрептомицина
Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (N 4) в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера). Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,9 +/- 0,1 (буф. N 6) готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед./мл.
Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.
Схема N 2
———T——————————————T————¬
¦ N ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация¦
¦раствора¦ ¦антибиотика,¦
¦ ¦ ¦ ед./мл ¦
+——–+——————————————+————+
¦ 1. ¦1 мл основного раствора + 9 мл буфера ¦ ¦
¦ ¦pH 7,8 +/- 0,10 ¦ 76 ¦
¦ 2. ¦1 мл 1 раствора + 9 мл -“- ¦ 7,6 ¦
¦ 3. ¦1 мл 2 раствора + 3,8 мл -“- ¦ 2,0 ¦
L——–+——————————————+————-
7.3. Приготовление контрольной концентрации
пенициллина
Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (буф. N 4) в соотношении 1:1, т.е. 1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина – 0,05 ед./мл.
Схема N 3
ПРИМЕРНАЯ СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРОВ ПЕНИЦИЛЛИНА
ИЗ СТАНДАРТНОГО АКТИВНОСТЬЮ 1586 ЕД./МЛ
———-T—————————————–T————¬
¦ N ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация¦
¦растворов¦ ¦антибиотика,¦
¦ ¦ ¦ ед./мл ¦
+———+—————————————–+————+
¦ 1. ¦0,6 мл стандартного раствора + 0,4 мл ¦ ¦
¦ ¦буфера pH 6,0 ¦ 1000 ¦
¦ 2. ¦0,1 мл раствора + 9,9 мл буфера pH 6,0 ¦ 10 ¦
¦ 3. ¦1 мл 2 раствора + 9 мл -“- -“- ¦ 1 ¦
¦ 4. ¦1 мл 3 раствора + 9 мл -“- -“- ¦ 0,1 ¦
¦ 5. ¦1 мл 4 раствора + 1 мл -“- -“- ¦ 0,05 ¦
L———+—————————————–+————-
7.4. Приготовление контрольной концентрации гризина
Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина (5 – 15 мг) и растворяют ее в 0,01 н HCl из расчета 1 мг или 1000 ед./мг.
Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на буфере N 7 (pH 3,2) по схеме N 4.
Схема N 4
———-T—————————————–T————¬
¦ N ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация¦
¦растворов¦ ¦антибиотика,¦
¦ ¦ ¦ ед./мл ¦
+———+—————————————–+————+
¦ 1. ¦1 мл основного раствора + 9 мл буфера ¦ 100 ¦
¦ 2. ¦1 мл раствора N 1 + 9 мл -“- ¦ 10 ¦
¦ 3. ¦4 мл раствора N 2 + 6 мл -“- ¦ 4 ¦
L———+—————————————–+————-
7.5. Приготовление контрольной концентрации
бацитрацина
Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина (10 – 20 мг) и растворяют ее в фосфатном буфере pH 6,0 (буфер N 4) до получения концентрации 100 ед./мл.
Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят (рабочее) контрольное разведение, равное 0,2 ед./мл по схеме N 5.
Схема N 5
———-T—————————————–T————¬
¦ N ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация¦
¦растворов¦ ¦антибиотика,¦
¦ ¦ ¦ ед./мл ¦
+———+—————————————–+————+
¦ 1. ¦1 мл основного раствора + 9 мл буфера ¦ 10 ¦
¦ 2. ¦2 мл раствора N 1 + 8 мл -“- ¦ 2 ¦
¦ 3. ¦1 мл раствора N 2 + 9 мл -“- ¦ 0,2 ¦
L———+—————————————–+————-
8. ПОДГОТОВКА ЧАШЕК ПЕТРИ
Колбы с агаром помещают в кипящую водяную баню. Для определения тетрациклинов используется среда N 3, стрептомицина – N 4, пенициллина – N 7, гризина – N 8, цинкбацитрацина – N 6. Расплавленный агар охлаждают до определенной температуры и вносят в него необходимое количество взвеси тест-культуры: аспорогенные культуры (Sar lutea, M. flavus) засевают при температуре среды не выше 48 град. C +/- 2 град. C, а споровые (Bac. cereus, Bac. cubtilis, Bac. mycoidis) при 58 град. +/- 2,0 град. C. Среду перемешивают круговыми движениями и разливают в чашки Петри по 10,0 +/- 0,1 мл, установленные строго на горизонтальном столе.
После застывания сред под дно чашек подкладывают трафарет (рис. 1 <*>) и пробочным сверлом N 3 (9 мм) вырезают 6 лунок, вырезанные блоки вынимают скальпелем.
——————————–
<*> Рисунки не приводятся.
9. ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
9.1. Исследование молока, молочных продуктов, яиц
Пробы молока и жидких молочных продуктов по 10,0 +/- 0,1 мл, творога по 10,0 +/- 0,1 г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,0 +/- 0,1 мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов – буфер N 3; для стрептомицина – буфер N 6; пенициллина – буфер N 5 (см. раздел 5. Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков). Таким образом, получается разведение 1:2.
Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,0 +/- 5,0 град. C в течение 10 +/- 0,1 мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,0 +/- 0,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов – буфер N 3, стрептомицина – буфер N 6.
Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,0 +/- 1 мин. при 37 град. C +/- 0,1 град. C, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,0 +/- 1,0 град. C в течение 20,0 +/- 0,1 мин.
Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 +/- 100 об./мин. в течение 10,0 +/- 0,1 мин. Надосадочная жидкость является первым разведение (1:2) и готова для внесения в лунки. Второе разведение (1:4) готовят в химических пробирках: 1,0 +/- 0,1 мл надосадочной жидкости приливают к 1,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).
В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,05 +/- 0,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2 – 4 чашки Петри, т.е. на каждое разведение по 1 – 2 чашки.
После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 20 +/- 2 часа при температуре 29 +/- 1,0 град. C (при определении тетрациклинов и пенициллина) или при 37 +/- 1,0 град. C (при определении стрептомицина).
На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах (п. 10.1).
9.2. Исследование мяса и мясных продуктов
Навески по 10,0 +/- 0,1 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком (предварительно простерилизованным), приливая 20,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов – буфер N 3, цинкбацитрацина – N 4, гризина – физиологический раствор (0,85% NaCl). При наличии микроразмельчителя тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,0 +/- 0,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмельчителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.
Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,5 +/- 0,5 час.
При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 65 +/- 5 град. C 30 мин. для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.
Центрифугируют пробы при 3000 об./мин. в течение 20 +/- 1 мин.
Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем п. 9.1 (когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из нее разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее – по тексту п. 9.1), либо следующим образом:
Надосадочную жидкость в количестве 0,05 +/- 0,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2 – 3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при +4 град. C для преддиффузии.
Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 18 +/- 0,5 час. при 29 +/- 1 град. C (определение тетрациклинов) либо при 37 +/- 0,1 град. C (определение гризина и цинкбацитрацина), после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах (п. п. 10.1, 10.2).
10. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Измеряют зоны задержки роста тест-культур и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах либо по таблицам, составленным В.С. Дмитриевой и С.М. Семеновым (Дмитриева В.С., Семенов С.М. “Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов”, М., 1965) (п. 10.1), или по стандартным кривым (п. 10.2).
10.1. Форма записи измерения зон задержки роста
тест-микробов при расчете активности антибиотиков,
содержащихся в виде остаточных количеств в пищевых
продуктах, по таблицам Дмитриевой В.С.
(Примерный образец)
——–T——————————————————–¬
¦N чашки¦ Диаметры зон задержки роста тест-микробов в мм ¦
¦ +————T————–T————-T————–+
¦ ¦ испытуемое ¦ стандартное ¦ испытуемое ¦ стандартное ¦
¦ ¦ разведение ¦ разведение ¦ разведение ¦ разведение ¦
¦ ¦ (1:3) ¦ 0,05 ед./мл ¦ (1:6) ¦ 0,05 ед./мл ¦
¦ ¦ ¦ (контроль) ¦ ¦ (контроль) ¦
+——-+————+————–+————-+————–+
¦ 1 ¦ 20 ¦ 16,5 ¦ 16 ¦ 16 ¦
¦ ¦ 20 ¦ 16,5 ¦ 16 ¦ 16 ¦
¦ ¦ 19,5 ¦ 16,5 ¦ 16,5 ¦ 16 ¦
+——-+————+————–+————-+————–+
¦среднее¦ 19,8 ¦ 16,5 ¦ 16,1 ¦ 16 ¦
+——-+————+————–+————-+————–+
¦ 2 ¦ 19 ¦ 16 ¦ 17,5 ¦ 16,5 ¦
¦ ¦ 19 ¦ 16 ¦ 17,0 ¦ 16,5 ¦
¦ ¦ 19,5 ¦ 16 ¦ 16,5 ¦ 16,5 ¦
+——-+————+————–+————-+————–+
¦среднее¦ 19,1 ¦ 16 ¦ 17 ¦ 16,5 ¦
L——-+————+————–+————-+—————
В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед./мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.
———–T———–T———-T————–T—————¬
¦Разведение¦ Зоны в мм ¦ Поправки ¦ Зоны после ¦ Среднее 2-х ¦
¦ ¦ ¦ ¦ поправки ¦ чашек ¦
+———-+———–+———-+————–+—————+
¦ 1:3 ¦ 19,8 ¦ +0,5 ¦ 20,3 ¦ 20,2 ¦
¦ ¦ 19,1 ¦ +1,0 ¦ 20,1 ¦ ¦
+———-+———–+———-+————–+—————+
¦ 1:6 ¦ 16,1 ¦ +1,0 ¦ 17,1 ¦ 17,3 ¦
¦ ¦ 17,0 ¦ +0,5 ¦ 17,5 ¦ ¦
L———-+———–+———-+————–+—————-
Определяют разность диаметров зон подавления роста при двух разведениях испытуемого препарата:
20,2 – 17,3 = 2,9 мм.
По таблице, соответствующей этой разности диаметров зон, находят значение активностей соответствующих диаметров зон подавления роста после поправки. В вертикальном столбце находят целые числа, в горизонтальном – десятые доли. Полученные значения умножают на соответствующие показатели разведения (2 и 4; 3 и 6).
2,15 ед./мл x 3 = 6,45 ед./мл (зона 20,2)
1,08 ед./мл x 6 = 6,48 ед./мл (зона 17,3)
—————————————–
среднее 12,93 : 2 = 6,465 ед./мл
Пример расчета. Если контрольная концентрация больше или меньше 1 ед./мл, то надо соответственно умножить или разделить на кратность этого числа 1 (К = 0,05 ед./мл, кратность = 20).
6,465 : 20 = 0,323, соответствует 6,465 x 0,05;
К = 2 ед./мл – 6,465 x 2 = 12,93 ед./мл.
10.2. Построение стандартных кривых
и расчет концентрации антибиотиков
10.2.1. Построение стандартной кривой при определении
концентрации хлортетрациклина
Для построения стандартной кривой используются рабочие растворы с концентрациями: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл приготовленные по схеме N 6.
Схема N 6
———T——————————————T————¬
¦ N р-ра ¦ Содержание растворов ¦Концентрация¦
¦ ¦ ¦ в ед./мл ¦
+——–+——————————————+————+
¦ 1. ¦1 мл основного р-ра + 8,3 буфера pH 5,1 ¦ ¦
¦ ¦+/- 0,1 (буфер N 2) ¦ 100 ¦
¦ 2. ¦1 мл р-ра N 1 + 9 мл буфера pH 5,1 ¦ ¦
¦ ¦+/- 0,1 (буфер N 2) ¦ 10 ¦
¦ 3. ¦2 мл р-ра N 2 + 5 мл -“- ¦ 4 ¦
¦ 4. ¦1 мл р-ра N 3 + 9 мл -“- ¦ 0,4 ¦
¦ 5. ¦5 мл р-ра N 4 + 5 мл -“- ¦ 0,2 ¦
¦ 6. ¦5 мл р-ра N 5 + 5 мл -“- ¦ 0,1 ¦
¦ 7. ¦5 мл р-ра N 6 + 5 мл -“- ¦ 0,05 ¦
¦ 8. ¦5 мл р-ра N 7 + 5 мл -“- ¦ 0,025 ¦
¦ 9. ¦2 мл р-ра N 7 + 8 мл -“- ¦ 0,01 ¦
L——–+——————————————+————-
В несколько проб (по 5 г) измельченной мышечной ткани или субпродуктов, не обработанных антибиотиками, вносят раствор антибиотика с вышеперечисленными концентрациями в количестве 5 мл. Перемешивают и оставляют на 18 +/- 1 час. при температуре +4 град. C. Затем центрифугируют при 3500 +/- 500 об./мин. в течение 25 мин. Надосадочная жидкость служит стандартом определенной концентрации антибиотика при построении кривой на полулогарифмической сетке (рис. 2). Надосадочную жидкость соответственно 5 – 6 рабочим концентрациям стандартного антибиотика вносят в количестве 0,05 +/- 0,001 мл в 2 – 3 лунки на 2 параллельных чашках Петри с засеянной тест-микробом средой. Инкубируют чашки, как указано в п. 9.2.
Рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микробов для каждой концентрации рабочего раствора стандарта из двух параллельных чашек и наносят их в виде точек на оси абсцисс. Из этих точек, а также из точек на оси ординат, соответствующих концентрациям рабочих растворов 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл, проводят вертикальные и горизонтальные прямые. Линия, соединяющая точки пересечения указанных прямых, – стандартная кривая <*>. Стандартную кривую строят для каждой партии питательной среды.
——————————–
<*> При отсутствии образцов мышечной ткани и субпродуктов, не обработанных антибиотиками, для построения стандартной кривой можно пользоваться рабочими растворами стандартного хлортетрациклина, приготовленными на буфере N 2 (р-ры 5, 6, 7, 8, 9), непосредственно внося их в лунки на чашке Петри.
10.2.2. Построение стандартной кривой для определения
концентрации гризина
Для построения стандартной кривой при определении гризина используются растворы с концентрациями: 1,6; 1,2; 0,8; 0,6; 0,4; 0,3; 0,2, после их контакта с мышечной тканью или субпродуктами. Указанные концентрации гризина делаются на физрастворе (0,85% NaCl) по схеме N 7.
Схема N 7
———T——————————————T————¬
¦ N р-ра ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация¦
¦ ¦ ¦ в ед./мл ¦
+——–+——————————————+————+
¦ 1. ¦р-р 1 мл основного р-ра + 9 мл физ. р-ра ¦ 100 ¦
¦ 2. ¦-“- 8 мл 1 р-ра + 2 мл физраствора ¦ 80 ¦
¦ 3. ¦-“- 6 мл 1 р-ра + 4 мл -“- ¦ 60 ¦
¦ 4. ¦-“- 2 мл 2 р-ра + 8 мл -“- ¦ 16 ¦
¦ 5. ¦-“- 1 мл 3 р-ра + 9 мл -“- ¦ 6,0 ¦
¦ 6. ¦-“- 1 мл 4 р-ра + 9 мл -“- ¦ 1,6 ¦
¦ 7. ¦-“- 1 мл 5 р-ра + 4 мл -“- ¦ 1,2 ¦
¦ 8. ¦-“- 4 мл 7 р-ра + 2 мл -“- ¦ 0,8 ¦
¦ 9. ¦-“- 6 мл 8 р-ра + 2 мл -“- ¦ 0,6 ¦
¦ 10. ¦-“- 3 мл 8 р-ра + 3 мл -“- ¦ 0,4 ¦
¦ 11. ¦-“- 3 мл 9 р-ра + 3 мл -“- ¦ 0,3 ¦
¦ 12. ¦-“- 4 мл 11 р-ра + 2 мл -“- ¦ 0,2 ¦
L——–+——————————————+————-
Далее поступают согласно методу, описанному в п. 10.2.1 настоящего раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значение концентраций контрольных растворов гризина, указанных выше.
10.2.3. Построение стандартной кривой при определении
концентрации цинкбацитрацина
Для построения стандартной кривой при определении цинкбацитрацина из основного раствора по схеме N 8 с использованием буфера N 4 готовят рабочие растворы с концентрациями: 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,06; 0,03; 0,02 ед./мл.
Схема N 8
———-T—————————————-T————-¬
¦ N р-ра ¦ Соотношение растворов ¦Концентрация,¦
¦ ¦ ¦ ед./мл ¦
+———+—————————————-+————-+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦
+———+—————————————-+————-+
¦1 раствор¦1 мл основного р-ра + 9 мл фосфатного ¦ ¦
¦ ¦буфера ¦ 10 ¦
¦2 раствор¦1 мл 1 р-ра + 9 мл фосфатного буфера ¦ 1 ¦
¦3 -“- ¦4 мл 2 р-ра + 1 мл -“- ¦ 0,8 ¦
¦4 -“- ¦1 мл 3 р-ра + 1 мл -“- ¦ 0,4 ¦
¦5 -“- ¦1 мл 4 р-ра + 1 мл -“- ¦ 0,2 ¦
¦6 -“- ¦1 мл 5 р-ра + 1 мл -“- ¦ 0,1 ¦
¦7 -“- ¦6 мл 6 р-ра + 4 мл -“- ¦ 0,06 ¦
¦8 -“- ¦1 мл 7 р-ра + 1 мл -“- ¦ 0,03 ¦
¦9 -“- ¦2 мл 8 р-ра + 1 мл -“- ¦ 0,02 ¦
L———+—————————————-+————–
Приготовление рабочих концентраций антибиотика и построение стандартной кривой производят согласно методу, описанному в п. 10.2.1 данного раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значения концентраций контрольных растворов цинкбацитрацина, указанных выше.
10.2.4. Расчет активности по стандартной кривой
Для экстракта (или его значения) исследуемой пробы рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микроба двух параллельных чашек и наносят его в виде точки на оси абсцисс полулогарифмической сетки. Из этой точки восстанавливают перпендикуляр и проводят его до пересечения со стандартной кривой. Через точку пересечения перпендикуляра со стандартной, параллельно оси абсцисс, проводят прямую до пересечения с осью ординат. Точка пересечения параллельной прямой с осью ординат указывает на активность антибиотика в экстракте исследуемой пробы – “С”. Если исследовалось разведение экстракта, то полученный показатель его активности умножают на показатель разведения экстракта.
Расчет содержания остаточных количеств антибиотиков в 1 г исследованного продукта (в том случае, когда стандартная кривая построена с использованием стандартных растворов, внесенных в гомогенаты мышечной ткани или субпродуктов) ведется по формуле:
X = C x 1,5,
где: X – активность антибиотика в 1 г продукта;
C – активность антибиотика в 1 мл экстракта исследуемой пробы;
1,5 – степень разведения пробы буфером, отличная от разведения стандартного гомогената.
В случае, когда для построения стандартной кривой использовались чистые растворы стандартного антибиотика, расчет ведут по той же формуле, изменив лишь степень разведения пробы буфером на 3, а именно: X = C x 3. В данном случае в ответе указывают, что стандартная кривая построена с использованием чистых растворов антибиотиков.
ПРИМЕРНАЯ ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
(ОТДЕЛЬНО ПО ВИДАМ АНТИБИОТИКОВ)
————-T—–T———————————————¬
¦Вид исследу-¦Общее¦ Положительные результаты ¦
¦емых продук-¦число+——T——T——————————-+
¦тов ¦проб ¦кол-во¦в % к ¦ в том числе в ед./мкг/мл/г ¦
¦ ¦ ¦ проб ¦общему+——-T——-T——-T——-+
¦ ¦ ¦ ¦кол-ву¦0,01 – ¦0,051 -¦0,11 – ¦ 1,1 и ¦
¦ ¦ ¦ ¦ проб ¦ 0,05 ¦ 0,1 ¦ 1,0 ¦ более ¦
+————+—–+——+——+——-+——-+——-+——-+
¦Мясо ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Мясопродукты¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Молоко ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Творог ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Сметана ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Яйца ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+————+—–+——+——+——-+——-+——-+——-+
¦ВСЕГО: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L————+—–+——+——+——-+——-+——-+——–
Примечания. 1. Для каждой новой партии питательной среды необходимо проверять зоны контрольного разведения стандартного раствора антибиотика.
2. Для внесения в лунки берется то рабочее (контрольное) разведение антибиотика, которое дает диаметр задержки роста тест-культуры, приблизительно 17 мм (16 – 18 мм).
3. Для внесения в лунки испытуемых разведений одной пробы можно пользоваться одной пипеткой, при этом надо начинать с большего разведения (1:4 или 1:6).
4. Каждая партия стандарта пенициллина и стрептомицина отличается своей активностью, и поэтому дается примерная схема приготовления рабочего разведения.
5. Стандарты антибиотиков и стандарты мутности можно выписать по следующим адресам:
а) г. Москва, 121002,
Сивцев Вражек, д. 41,
Государственный Институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича;
б) г. Москва,
Звенигородское шоссе, д. 5,
Гос. Научно-контрольный институт ветпрепаратов.